[发明专利]一种检测凝血因子V基因多态性的试剂盒、方法及用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种凝血因子V基因多态性的检测试剂盒、方法和用途。更具体的，本发明涉及通过聚合酶链式反应方法，提供一种分析编码凝血因子V基因的R506Q多态性位点基因型的试剂盒、方法和用途。

背景技术

先天性血栓性疾病也称遗传性血栓形成倾向，是由于凝血，抗凝和纤溶系统某个环节的特异性障碍而引起的一类疾病，以复发性静脉血栓为主要临床表现，大多属先天遗传性，常首发于青少年时期。据西欧部分地区统计，发病率在20/100000以上，超出先天性出血性疾病。

继发于一些疾病的高凝状态和血栓形成与原发于凝血、抗凝血机理缺陷的先天性血栓性疾病不同，常表现为止血，抗血栓机理非特异性，多环节的变化，病因多数是复合性的。生理或一些体外的因素也可导致高凝状态，如高龄、妊娠、产后、剧烈运动、情绪激动、寒冷、吸烟、高脂饮食、药物(口服避孕药)等。不少内科疾病引起的高凝状态和血栓形成包括：①肿瘤；②自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎，Behcet综合征；③内分泌及代谢性疾病：糖尿病、肾上腺皮质功能亢进；④肾脏疾病：肾病综合征；⑤肝脏疾病；⑥心、脑血管疾病：心绞痛、心肌梗塞、脑血栓、脑栓塞、短暂性脑缺血、闭塞性脉管炎，原发性高血压；⑦血液病：弥散性血管内凝血、血栓性血小板减少性紫癜、夜间阵发性血红蛋白尿、骨髓增生综合征；⑧肺部疾病：肺栓塞、慢性阻塞性肺炎、成人呼吸困难综合征；⑨高粘血症：白血病、红细胞增多症镰形红细胞病、高免疫球蛋白血症；⑩高脂血症。

静脉血栓形成(venous thrombosis，VT)在发达国家年发病率1‰，且随年龄增长呈递增现象。儿童的发病率1/10万，老年人接近1％。静脉血栓形成多发生在下肢深静脉，与其相关的主要并发症是血栓后遗综合征及致死性的肺动脉栓塞，发生率分别是20％及1％～2％。我国尚缺乏大规模血栓流行病学的调查资料。从近些年我科收治的病人来看，静脉血栓形成是常见病、多发病。研究证明，凝血因子的基因多态性与血栓形成密切相关。静脉血栓是一种多因子疾病，既有遗传因素，又有后天获得的一些危险因素。因子V和因子II(凝血酶原)是两种最常见的影响家族性血栓形成倾向的因子，家族性血栓形成倾向是一种威胁健康甚至造成死亡的疾病。用常规临床检测方法通常很难发现静脉血栓，但是，对于有家族史以及有其他严重疾病的患者，通过遗传预置筛查检测有关致病因子，可能是预防这类疾病的一种合适途径。

凝血因子V(F V)是一单链糖蛋白，分子量为330kD，主要在肝脏合成。F V基因定位于染色体1q23，长约80kb，有25个外显子，其cDNA长6672bp，编码含2224个氨基酸的蛋白质。研究表明，F V基因第10号外显子第1691位上的G→A可引起高凝状态。此点突变使F V蛋白分子第506位的精氨酸变成了谷氨酰胺(Arg→Gln)，这种突变的蛋白分子称为FV Q506或FV Leiden突变，该突变影响了蛋白C系统的抗凝功能。上面提到506位Arg是APC灭活FV的第一个切割位点。Arg506→Gln导致APC灭活FV延长，这一结果使得FV对外源性APC产生抵抗而使APTT不能延长。同时，突变的FV仍保持促凝活性，以及它灭活的延长使得凝血酶形成速度加快，凝血酶的增加又反馈性激活FV、F VIII使得凝血与抗凝血平衡失调导致高凝状态形成。

FV Leiden突变，使得凝血酶形成增加，抑制了纤溶过程，这表明FV Leiden突变的患者不仅比正常人易形成血栓，且形成后血栓不易被溶解。FV Leiden突变在欧洲人口中比例2～7％。VT病人中占20～50％。FV Leiden突变杂合子发生血栓的相对危险性是正常人的7倍，而纯合子高达80倍。

最常见的基因多态性为单核苷酸基因多态性(SNP)，即同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化，主要表现为基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性。传统的SNP检测方法是采用一些已有的成熟技术，如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gelelectrophoresis，DGGE)和等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)等。

发明内容

本发明的目的是提供一种稳定可靠的高通量的检测凝血因子V基因型的试剂盒、方法和用途。具体，包括了检测凝血因子V基因的R506Q多态性位点基因型的试剂盒、方法和用途。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：