[发明专利]透明质酸化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种透明质酸(hyaluronic acid，以下简称HA)生物素-亲和素间接包被技术结合化学发光免疫分析技术测定试剂盒及其制备方法。

背景技术

透明质酸是一种大分子氨基多糖，由间质细胞合成，在体内参与基质的构成，主要由肝窦内皮细胞摄取和分解。由于HA主要在肝脏内代谢，肝病患者尤其是肝硬化患者HA代谢障碍，血中HA浓度显著升高，因而HA是肝硬化的一个良好血清学指标。HA实验室检测方法主要为免疫分析，常用检测方法为放射免疫分析(RIA)和酶免疫分析(EIA)，目前使用最广的为酶免疫分析(EIA)。

化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay，CLIA)是近十年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析，是继放射免疫分析(RIA)和酶免疫分析(EIA)之后发展起来的一种超高灵敏度的微量测定技术。具有高灵敏度、检测范围宽、操作简便快速、标记物稳定性好、无污染、仪器简单经济等优点。它是放射性免疫分析与普通酶免疫分析的取代者，是目前免疫定量分析最理想的方法。

亲和素-生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，其中包括反应信号放大、间接包被等形式。反应信号放大即为生物素化的抗原或抗体与酶标记的亲和素反应体系，其优点是利用生物素-亲和素放大效应提高检测灵敏度，缺点为亲和素的等电点较高，对聚苯乙烯等固相载体有较高的非特异吸附而导致较高的本底。本发明以亲和素包被固相载体，通过亲和素-生物素系统间接包被生物素化的抗体，不仅便于放大生产、易于监控生产过程，而且避免了直接包被固相存在的活性损失大、工艺优化繁琐等缺点，同时保证了批次间的稳定性。

本发明的目的是为了解决目前临床上放免试剂有效期短、放射性废弃物污染危害以及酶免试剂灵敏度低、精密性差等不足。本发明的透明质酸化学发光测定试剂盒，经临床实验证明，操作简便，灵敏度高，特异性好，与肝活检结果符合度极高，提供了一种高效、灵敏、稳定、特异的无创肝纤维化诊断技术。

发明内容

本发明将生物素-亲和素间接包被技术结合化学发光技术与透明质酸的免疫分析法有效地结合，提供了一种能够简便、快速、灵敏、稳定地检测透明质酸的试剂盒。本发明的试剂盒克服了放免试剂和酶免试剂的诸多不足，适于在产业上有效地推广应用。

本发明的目的是提供一种生物素-亲和素间接包被技术结合化学发光免疫分析测定透明质酸的试剂盒。

本发明的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。

根据本发明的试剂盒包括：1)透明质酸校准品；2)亲和素化的固相载体；3)生物素化的透明质酸多克隆抗体或单克隆抗体；4)透明质酸结合蛋白标记物；以及5)上述标记物所作用的化学发光底物。

根据本发明的试剂盒，其中，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒；所述标记物为酶标记物或化学发光剂标记物；所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶；所述化学发光剂为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺；所述化学发光底物为1，2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺、异鲁米诺或过氧化氢，其中所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。

进一步，本发明提供了一种制备上述试剂盒的方法，包括以下步骤：

1)以透明质酸纯品配制透明质酸校准品；

2)固相载体包被亲和素；

3)使透明质酸的多克隆抗体或单克隆抗体生物素化；

4)标记透明质酸结合蛋白；

5)配制化学发光底物；

6)配制洗涤液；

7)分装上述透明质酸校准品、生物素化的透明质酸的多克隆抗体或单克隆抗体、透明质酸结合蛋白标记物、化学发光底物和洗涤液；以及

8)组装为成品。

本发明的方法，其特征在于，所述固相载体包被亲和素的步骤2)采用以下方法：

用0.050M pH值为9.6的碳酸盐缓冲液配制成所需浓度的亲和素包被液，并将包被液负载于固相载体上；经生理盐水洗涤、BSA封闭，抽湿干燥后用铝箔袋密封。