[发明专利]应用发酵生产L-苏氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物工业。特别是涉及应用微生物发酵生产L-苏氨酸的方法，以及用于该生产方法的基因工程菌。

背景技术

苏氨酸是动物维持生长所必需的氨基酸，在以菜籽粕或大豆粕为蛋白质主要来源的生猪低蛋白质日粮中，赖氨酸是第一限制性氨基酸，苏氨酸是第二限制性氨基酸。L-苏氨酸广泛用于动物饲料和食品添加剂，以及用作医学或药物学用途的流体和合成材料。L-苏氨酸是使用衍生自野生型大肠杆菌、棒状杆菌属、杀雷氏菌(Serratia)、普罗威登斯菌(Providencia)等的合成突变体以及它们的二氨基庚二酸、甲硫氨酸、赖氨酸或异亮氨酸营养缺陷的合成突变体(日本专利申请公开号平2-219582，申请人Microbiolo.Biotechnol.，以及韩国专利公开号92-8365)。中国专利公开号85104604A公开了一种采用短杆菌属细菌的α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)和S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)双重抗性变异株生产L-苏氨酸的方法。韩国专利申请号90-22965公开了一种L-苏氨酸生产菌株TF4076(KFCC10718)，它是甲硫氨酸营养缺陷型并且抗苏氨酸类似物(AHV：α-氨基-β-羟基戊酸)、赖氨酸类似物(AEC：S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸)、异亮氨酸类似物(α-氨基丁酸)和甲硫氨酸类似物(乙硫氨酸)。

在大肠杆菌中L-苏氨酸的合成路线主要是：

在大肠杆菌中，L-苏氨酸的合成从天冬氨酸开始，天冬氨酸在天冬氨酸激酶I(AK I)催化下转变为天冬氨酰磷酸，经过还原最后生成高丝氨酸。天冬氨酸激酶I(AK I)是一个多功能酶，从天冬氨酸到高丝氨酸的代谢均由AK I催化。AK I由thrA基因编码。高丝氨酸在高丝氨酸激酶催化下磷酸化，磷酸化的高丝氨酸通过苏氨酸合成酶合成L-苏氨酸。高丝氨酸激酶由thrB基因编码，而苏氨酸合成酶由thrC基因编码。

对苏氨酸的代谢调节，现在研究得比较清晰。在L-苏氨酸的代谢过程中，thrA基因编码的AK I起决定作用。一般大肠杆菌合成苏氨酸的量有限，因为L-苏氨酸抑制AK I酶的活性，并通过苏氨酸-tRNAs调节苏氨酸操纵子的转录。苏氨酸类似物可以用来筛选苏氨酸生产菌种，如在α-氨基-β-羟基戊酸的抗性菌株中，thrA基因发生突变，突变基因编码的AK I酶抵抗苏氨酸的反馈抑制，从而导致苏氨酸的积累。在具有抗生素borrelidin抗性的大肠杆菌中，苏氨酸-tRNAs合成酶的构象发生变化，大大降低了与苏氨酸的亲和力，使苏氨酸大量积累。

限制苏氨酸大量合成的另一个主要因素来源于异亮氨酸，异亮氨酸的合成以L-苏氨酸为原料。因此，如果其合成途径不切断，只能导致异亮氨酸的积累，而L-苏氨酸含量不会增高；另一方面，异亮氨酸对thrA基因的转录水平具有强烈的反馈抑制，高含量的异亮氨酸阻断AK I酶的合成。

发明内容

本发明的主要目的是通过改变菌种的代谢调节，寻找到一种能高产苏氨酸的基因工程菌。为达到上述目的，本研究人员进行了不懈的努力和勤奋的研究，结果成功地获得了经过下述改性的大肠杆菌：(1)琥珀酰高丝氨酸合成酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的细胞内活性减弱；(2)苏氨酸脱氨酶的细胞内活性降低；(3)天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶和磷酸烯醇式丙酮酸激酶的细胞内活性增强；和/或(4)导入了来自透明颤菌的血红蛋白基因。(下文也称“本发明的细菌”)

优选的，本发明的细菌是包括上述所有改性的大肠杆菌；最优选的，本发明改性的大肠杆菌是基因工程菌K21P3。

在本发明中，术语“细胞内活性增强”表示与野生型菌株(例如大肠杆菌BL21菌株)或亲本菌株(该菌株在本发明特定的组合中包括所有酶的细胞内活性都没有增强的菌株)相比，细胞内的酶促活性增强，还表示一种细菌具有一种野生型菌株或亲本菌株所没有的酶促活性。

在本发明中，术语“细胞内活性降低”表示与野生型菌株或亲本菌株相比，细胞内的酶促活性减弱。用于测定上述酶活性的方法是公知的，并且，本领域技术人员可以方便准确地证实酶在细胞内的活性是增强或是减弱。