[发明专利]应用发酵生产L-苏氨酸的方法

权利要求书

1、一种大肠杆菌变体，其中琥珀酰高丝氨酸合成酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的细胞内活性降低。

2、根据权利要求1所述的大肠杆菌变体，其中所述的细胞内活性降低是通过化学诱变和紫外诱变完成的；其中经过所述化学和紫外诱变后，琥珀酰高丝氨酸合成酶的突变包括：脯氨酸取代第61位的丝氨酸，丝氨酸取代第107位的甘氨酸，组氨酸取代第165位的丝氨酸；二氢吡啶二羧酸合成酶的突变包括：丙氨酸取代第44位的苏氨酸，赖氨酸取代第55位的谷氨酸，和组氨酸取代第65位的天冬氨酸；经过上述诱变所得到的是大肠杆菌K16P2株。

3、根据权利要求1或2所述的大肠杆菌变体，其中还包括苏氨酸脱氨酶的细胞内活性降低，所述的苏氨酸脱氨酶的细胞内活性降低是通过Red同源重组技术敲除苏氨酸脱氨酶基因完成的。

4、根据权利要求1或2所述的大肠杆菌变体，其中还包括天冬氨酸激酶的细胞内活性增强，其中所述的天冬氨酸激酶的细胞内活性增强通过下述方法实现：改造与苏氨酸结合的位点，去除L-苏氨酸对天冬氨酸激酶I的反馈抑制作用和通过改造与赖氨酸结合位点去除L-赖氨酸对天冬氨酸激酶III的反馈抑制作用；优选的，其中所述去除L-苏氨酸对天冬氨酸激酶I(AK I)反馈抑制作用的突变包括：用另一种氨基酸取代109位上的丝氨酸，用另一种氨基取代163位上的丝氨酸；或者，其中用甘氨酸取代109位上丝氨酸；用丙氨酸取代163位上的丝氨酸。

5、根据权利要求4所述的大肠杆菌变体，其是大肠杆菌BL1126P，该菌种的保藏号为：CGMCC No：2369。

6、根据权利要求4所述的大肠杆菌变体，其中所述去除L-赖氨酸对天冬氨酸激酶III(AKIII)的反馈抑制作用的突变包括：用另一种氨基酸取代330位上的甘氨酸，用另一种氨基酸取代400位上的半胱氨酸，用另一种氨基酸取代403位上的甘氨酸；或者，用天冬氨酸取代330位上的甘氨酸，用甘氨酸取代400位上的半胱氨酸，用天冬氨酸取代403位上的甘氨酸。

7、根据权利要求6所述的大肠杆菌变体，其是大肠杆菌BL2125P，该菌种的保藏号为：CGMCC No：2367。

8、根据权利要求1-7中任意一项所述的大肠杆菌变体，其中进一步包括天冬氨酸-β-半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶和/或磷酸烯醇式丙酮酸激酶中的至少一种酶的细胞内活性增强，优选的，其中所述细胞内酶活性的增强是通过增加质粒表达量而提高其细胞内活性。

9、根据权利要求8所述的大肠杆菌变体，其中进一步包括导入了血红蛋白基因；优选的，其中所述的血红蛋白基因来源于透明颤菌的血红蛋白基因；且所形成的大肠杆菌变体是基因工程菌K21P3。

10、一种生产L-苏氨酸的方法，该方法包括在在合适的培养基中培养权利要求1-19中任意一项所述的大肠杆菌变体，在其培养基中产生和聚集L-苏氨酸，并从中收集L-苏氨酸；其中所述的细菌是经过下述改性的大肠杆菌：(1)琥珀酰高丝氨酸合成酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的细胞内活性减弱；(2)苏氨酸脱氨酶细胞内活性降低；(3)天冬氨酸-β-半醛脱氢酶、天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶和磷酸烯醇式丙酮酸激酶细胞内活性增强；和/或(4)导入了来自透明颤菌的血红蛋白基因；其中所述的高丝氨酸合成酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、天冬氨酸-β-半醛脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸激酶和苏氨酸脱氨酶分别源于大肠杆菌；优选的，其中所述的大肠杆菌变体是基因工程菌K21P3；更优选的，其中所述的培养在有氧条件下进行36～60时；培养期间的温度控制在37℃左右；pH值控制在6～8之间；并可使用无机或有机酸或碱性物质以及氧气调节pH值。