[发明专利]一种铁皮石斛无菌苗的无激素培养及快速繁殖方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说涉及一种铁皮石斛无菌苗的无激素培养及快速繁殖方法。

技术背景

石斛是传统名贵中药，具有很好的疗效，根据《中国药典》2005版的记载，石斛具有益胃生滓，滋阴清热的功效，还有利咽明目，调节人体免疫力的作用。可作药用的石斛属植物有30多种，其中铁皮石斛(Dendrobium candidum Wall.ex Lindl)最为名贵，它又称黑节草，民间称其为救命仙草，医学界称其为药界大熊猫。由于使用量的增加，以及资源的短缺，其价格不断飚升，目前干品的价格已经到了每公斤2万多元。在利益驱动下，产区药农对野生铁皮石斛资源毁灭性采挖，加之铁皮石斛繁殖率低，生长缓慢等特点，已经处于极度濒危状态，我国政府已将野生石斛资源列入国家二类保护植物。国家鼓励开展应用生物技术进行铁皮石斛大规模繁殖的研究，以保障其资源的可持续利用。

铁皮石斛的种子极其细小，在自然界很难萌发，野生苗基本上依靠无性繁殖的方法繁殖后代。但是种子可以在无菌条件下萌发，经过原球茎阶段形成植株。我们使用显微镜调查发现，铁皮石斛每个蒴果内的种子量非常巨大，为4万粒左右。使用种子繁殖组培苗较其它方法具有以下优势：有性繁殖可以保证具有优良性状，操作简便，成苗速度快，一定时间内获得优质种苗的数量巨大，能满足快速繁殖的需要。

关于铁皮石斛的组织培养和无性繁殖已有相关研究报道，但绝大部分的培养方法都添加了激素以促进植株的分化和生长，并且研究内容不系统。激素的长期应用，会导致组培苗的优良性状发生退化或变异。作为药用植物来说，外源激素的使用不利于人的健康。此外，报道中使用的组织培养方法操作复杂，费用昂贵，且需要的人员多，占用空间大。本发明使用的培养方法操作简便，费用低廉，不需要对组培苗进行频繁继代，较好的解决了以上问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种铁皮石斛无菌苗的无激素培养及快速繁殖的方法。该方法操作简便，成本低廉，培养过程中不使用激素，较好地解决了目前普遍存在于铁皮石斛组织培养过程中的培养成本高和大量使用激素这两方面问题。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

1、种子的无菌萌发

采摘铁皮石斛的果实，进行表面消毒处理；将种子播种在常规石斛无菌萌发培养基上诱导种子无菌萌发。

2、原球茎及种苗的诱导和培养

播种后的培养瓶置于原球茎及种苗诱导条件下培养，培养条件为：温度10-27℃，光照可以为：红光，绿光，无光，黄光，蓝光；种子萌发形成原球茎或种苗。

3、无菌苗的生根

根据需要，将上述条件下培养的种苗转移到诱导生根的条件下培养，以获得大量性状优良的无菌苗；诱导生根的培养条件为：自然光或日光灯，每日光照8-24小时，光照强度500-6000Lx；培养温度为10-30℃。

4、无菌苗的增殖及壮苗培养

生根的无菌苗可以经过增殖、壮苗程序获得大量无菌苗；也可以直接在壮苗培养基中进行壮苗；

增殖方法为：在以下两种培养基中交替培养，在每种培养基上的培养周期均为3-6个月，交替1-2次；两种培养基的组成分别为：①N6培养基，蔗糖，琼脂；②N6培养基，蔗糖，琼脂，天然附加物；

增殖和壮苗培养的培养条件均为：自然光或日光灯，每日光照8-16小时，光照强度为1000-6000Lx，培养温度为10-30℃，继代周期为3-6个月，最终获得壮苗；

壮苗培养基组成为：N6培养基，蔗糖，活性碳，琼脂，天然附加物。

5、无菌苗的练苗及移栽

壮苗培养后的无菌苗，经过练苗，即可出瓶移栽；

练苗方法为：先将培养瓶从壮苗培养条件转移到遮荫和自然变温的条件下，放置7-14天；然后打开培养瓶的瓶口，再放置2-4天；

出瓶移栽的方法为：无菌苗出瓶后，用自来水洗净培养基后，栽种到花盆或育苗盘或苗圃中；栽种基质为：碎石块∶木块或树皮∶水苔＝1-3∶1-2∶0.3-1；栽种后要保持环境通风、遮阳，湿度60％-90％；按时浇水，待苗成活，长出新根、新叶后即可移栽大田。

上述方法中，无菌苗增殖所用的两种培养基的组成，按重量百分比分别为：

(1)N6培养基，蔗糖40-60g/L，pH5.5-6.0，琼脂7-15g/L；

(2)N6培养基，蔗糖40-60g/L，pH5.5-6.0，琼脂7-15g/L，在此培养基上添加天然附加物，天然附加物可以是：椰子汁60-200g/L，香蕉汁60-200g/L，土豆汁60-200g/L，番茄汁50-150g/L，绿豆汁50-200g/L；