[发明专利]体内生产头孢菌素的改良

说明书

本发明的领域

本发明属于重组DNA技术领域。更具体地，本发明涉及利用遗传修 饰的宿主生物生产头孢菌素、如此修饰的宿主生物以及其中使用的DNA 等领域。本发明还涉及重组DNA在所述宿主生物中表达的修饰酶。

本发明的背景

β-内酰胺抗生素构成最重要的一类抗生素化合物，有着长期的临床 使用历史。在这一类中，最为突出的是青霉素和头孢菌素。这些化合物 分别由丝状真菌例如产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和Acremonium chrysogenum天然产生。

作为经典菌株改良技术的结果，在过去数十年中产黄青霉和 Acremonium chrysogenum中抗生素的生产水平已获得了巨大的增加。 随着产生青霉素和头孢菌素的生物合成途径的知识增加，以及重组DNA 技术的出现，已有了新的工具用于生产菌株的改良和这些化合物的体内 衍生化。

β-内酰胺生物合成所涉及的大多数酶已被鉴定而且已克隆了其相应 的基因，参见Ingolia和Queener，医学研究评论(Med.Res.Rev.)9 (1989)，245-264(生物合成途径和酶)，和Aharonowitz，Cohen和 Martin，微生物年评(Ann.Rev.Mcriobiol.)46(1992)，461-495(基因克 隆)。

产黄青霉中青霉素生物合成的前两步是三个氨基酸L-5-氨基-5-羧基 戊酸(L-α-氨基己二酸)(A)，L-半胱氨酸(C)和L-缬氨酸(V)缩 合成三肽LLD-ACV，接着该肽环化形成异青霉素N。该化合物含有典型 的β-内酰胺结构。

第三步涉及L-5-氨基-5-羧基戊酸的亲水侧链在酰基转移酶的作用下 交换为疏水侧链。由酰基转移酶介导的该酶促交换反应发生在细胞器微 体内，参见EP-A-0448180。

头孢菌素比青霉素贵得多。一个原因是，一些头孢菌素(如头孢氨苄) 是由青霉素经过许多化学转化形成的。另一个原因是，至今只有带有D-5- 氨基-5-羧基戊酰基侧链的头孢菌素可进行发酵转化。到目前为止，头孢 菌素C作为这方面最为重要的起始物，在任何pH均易溶于水，因此这 就意味着需采用烦琐且昂贵的柱技术进行既费时又昂贵的分离程序。以 这种方法获得的头孢菌素C必须经过许多化学和酶学转化才能形成医药 用头孢菌素。

目前工业上偏好的制备中间产物7-ADCA的方法涉及导致青霉素G 扩环和衍生化的复杂化学步骤。制备7-ADCA的一个必要化学步骤是五 元青霉素环结构扩展为六元头孢菌素环结构(见例如美国专利 4,003,894)。这个复杂的化学处理既昂贵又对环境有害。

因此，人们非常想用酶学反应例如酶学催化，优选体内过程中进行的 酶学反应，来替代该化学过程。由体内酶学方法替代该化学扩展方法的 一个关键是头孢菌素生物合成途径的中心酶，去乙酸基头孢菌素C合成 酶(DAOCS)，也称为“扩环酶(expandase)”。

发现细菌带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)的扩环酶在某 些情况下可进行青霉素环结构的扩展。当导入产黄青霉时，该酶可体内 转化青霉素环结构为头孢菌素环结构，参见Cantwell等，Proc.R.Soc. Lond.B.248(1992)，283-289。该扩环酶及其相应的基因cefE的生物 化学和功能特性已进行了很好的分析(EP-A-0366354)。cefE基因的 物理图谱(EP-A-0341892)、DNA序列和用cefE在产黄青霉中进行的 转化研究也均有描述