[发明专利]PCR－mtDNA检测总禽源性成分的扩增引物及其检测试剂盒和使用方法

权利要求书

1.一种用于检测总禽源性成分的特异性PCR-mtDNA扩增引物，其特征是上下游长度分别为18bp和19bp的核苷酸，序列如下：

上游引物PF：5′-AGAACTACGAGCACAAAC-3′；

下游引物PR：5′-GCTATACCTTGACCTGTCT-3′。

2.如权利要求1所述的用于检测总禽源性成分的特异性PCR-mtDNA扩增引物，其特征是还包括有所述的特异性引物的扩增条件为94℃预变性5min，1个循环，然后进入PCR循环：94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸20sec，设计35个循环，最后72℃延伸3min。

3.如权利要求1所述的用于检测总禽源性成分的特异性的PCR-mtDNA检测的试剂盒，其特征是包括有：①10×PCR缓冲液，其中含Mg²⁺20mmoL/L；②dNTP，其中2.5mmoL/L；③上游引物PF，其中25pmoL/L；④下游引物PR，其中25pmoL/L；⑤Taq酶，2U/μL；⑥灭菌超纯水；⑦DNA模板。

4.如权利要求3所述的用于检测总禽源性成分的特异性的PCR-mtDNA检测的试剂盒的使用方法，其特征是包括有如下步骤：

(1)待检物DNA的提取；

(2)将试剂盒中各组分与待检物DNA混合，按权利要求2的条件进行PCR扩增；

(3)PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，含有总禽源性成分的检测物被引物PF+PR扩增出DNA特异性片段，呈阳性。

5.如权利要求4所述的用于检测总禽源性成分的特异性的PCR-mtDNA检测的试剂盒的使用方法，其特征是所述的DNA的提取有如下步骤：

①称取0.03g研碎的待检测物样品于高压灭菌后的1.5ml离心管中，加入500μl细胞裂解液消化；

②加入蛋白酶K10μl，浓度为20mg/ml慢速搅拌使之溶解并混匀，如需要可再次加入蛋白酶K，置于50℃水浴中消化过夜，适时混匀多次；

③将细胞裂解液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，温和地转动离心管混匀两相，使水相与酚形成乳状液；

④4℃13000rpm/min离心10min，从离心机中取出离心管，禁止晃动，有清晰的分层，上层为水相，提取的DNA便在这上层水相中，下层为酚相，一般为黄色，中间有白色的絮状物为蛋白质，用大口的tip头吸出上层水相，移至另一干净离心管中，尽量不要吸出两相的交界面；

⑤加入RNase3μl，浓度为1.5μl/ml，轻轻混匀37℃水浴1h；

⑥降至室温后，再加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇，其比例为25∶24∶1，温和的混匀两相，振荡2min，形成均匀乳浊液；

⑦重复步骤④；

⑧加入等体积的氯仿∶异戊醇，其比例为24∶1，使两相充分混匀继续抽提；

⑨重复步骤④；

⑩在水相中加入1/10体积的3MNaAc混匀后，再加入两倍体积的预冷的无水乙醇，弃上清液；

用70％乙醇漂洗1次，13000rpm离心5min，弃上清液，将离心管倒置于灭菌的滤纸上10～15min使乙醇挥发，干燥10～15min；

加入30μl TE缓冲液，室温放置24h，然后4℃保存备用。