[发明专利]德国肉用美利奴羊肌肉生长抑制素基因SNP位点

说明书

技术领域

本发明是涉及德国肉用美利奴肌肉抑制素myostatin基因外显子1单核苷酸多态性，本发 明还涉及肌肉抑制素myostatin基因外显子1等位基因突变的方法。

背景技术

肌肉的生长发育受到众多生长发育因子的调控，肌肉抑制素基因是目前发现的功能较为明 确的负调控基因，主要在骨骼肌中表达。对小鼠、比利时蓝牛、皮艾蒙特牛、德克塞尔羊、 小灵狗等的研究证实，由于缺失该基因或该基因编码区发生突变，导致该基因活性丧失或被 抑制，造成肌肉过度生长，因而确定其具有特异的抑制骨骼肌生长的功能。筛选myostatin基 因突变等位基因或用分子生物学方法干扰、阻断myostatin基因的负调控作用，对于肉用动物 品种的选育和提高产肉性能方面具有重要意义。在本申请之前，没有发现关于德国肉用美利 奴myostatin基因外显子1多态性的相关报道。

德国肉用美利奴myostatin基因外显子1上发现的单核苷酸突变为同义突变。由于密码的 简并性，不改变编码的氨基酸，但由于改变了核苷酸序列，有可能影响转录后加工mRNA接 切信号顺序。由于存在同义突变，在mRNA到蛋白质的翻译过程中，携带氨基酸残基结合到 核糖体上的tRNA就不相同，从而tRNA丰度也不同，如果同义突变后对应的tRNA在细胞 内丰度小，那么将会导致蛋白质的合成效率下降，最终影响基因的表达量。

方法内容

本发明的目的是提示在德国肉用美利奴myostatin基因外显子1上发现一个单核苷酸突变 位点，而该位点仅在该肉用绵羊品种中存在，并提供该等位基因突变的检测方法。

检测内容及方法：1确定德国肉用美利奴myostatin基因外显子1单核苷酸突变位点位 于SEQ ID：DQ530260所示序列从起始密码子ATG开始第+84位的位置，由GG等位基因突变 为GA等位基因。2检测该突变等位基因的特异性核酸引物，来源于SEQ ID：DQ530260，长 度为33bp和25bp，能够特异性的结合到突变等位基因模板链上，可以扩增到含有等位基因 突变的目的基因。3通过设计的核苷酸引物以及建立的检测体系，较为准确、快捷的扩增群 体中等位基因，通过SSCP分析，可以准确的分析得到绵羊myostatin基因外显子1单核苷酸 突变位点存在与否。

具体实施方式

1体外扩增

(1)采集绵羊血液，使用肝素纳抗凝，用酚氯仿抽提的方法提取基因组DNA。

(2)使用特异结合的核苷酸引物对基因组DNA模板进行体外扩增

(3)PCR扩增反应体系：10×PCR buffer(Mg2+free)2μL，25mM MgCl 1.3uL，10mmol/L dNTP混合物1μL，10μmol/L引物(上游)0.5μL，10μmol/L引物(下游)0.5μL，Taq酶 1.25U，100ng/μL DNA模板1μL，ddH2O补足20μL。

(4)PCR反应程序：95℃ 5min 1个循环；94℃ 45s，58℃退火35s，72℃ 40s共35 个循环；72℃ 5min 1个循环。

2 SSCP分析

(1)PCR产物经琼脂糖凝胶检测后，如果片段长度为393bp，那么将PCR产物∶甲酰 胺变性缓冲液按1∶1体积比98℃变性10min，然后立即置于冰中冷却，5min后上样进行聚 丙烯酰胺凝胶电泳。

(2)电泳使用凝胶配置：7.7％非变性PAGE凝胶

29％丙烯酰胺-1％N，N-双丙烯酰胺    7.7mL

5×TBE                             3mL

10％过硫酸铵(AP)                   0.21mL

TEMED(四甲基乙二胺)                20μl

去离子水                           14.77mL

总体积                             30mL

(3)电泳前先在4℃环境、300V电压下凝胶预电泳30min，然后将变性后产物加入加样 孔，在4℃环境、180V电压条件下电泳19hr。