[发明专利]一种黑曲霉菌株及其用于生产的甘草酸

说明书

发明领域

本发明涉及一种植物内生菌发酵生产甘草酸的技术领域，具体地说，涉及一种黑曲霉菌株及其用于产甘草酸的领域。

背景技术

甘草酸(Glycyrrhizic Acid)属于三萜皂甙化合物类，为白色或淡黄色结晶型粉末，熔点220℃，有特殊甜味，其分子式为C₄₂H₆₂O₁₆，相对分子量822.92。是传统中药甘草根部的提取物，也是其主要的药用有效成分之一。甘草酸不仅具有增甜、增香和增加风味的作用，而且还具有肾上腺皮质激素样作用和抗炎、抗变态反应、解毒、镇咳、抗肿瘤、影响脂质代谢、抑制艾滋病毒等作用，甘草酸已被广泛地应用于食品和药品领域。

目前由于中药的一些无序开发，资源枯竭，生物多样性锐减，多数药用植物的天然资源稀缺，甘草已成为渐危植物，且情况日益严重。而另一方面国内外对其有效成分甘草酸的需求越来越大。在这种供求矛盾的情况下，对甘草资源的保护性利用及寻找新的甘草酸来源非常有必要。人工栽培由于生长期长，受外界环境因素影响大，难以满足社会需求，为寻找新的甘草酸来源，增加甘草酸的产量，国内外均有人曾试图通过甘草细胞培养技术大量生产甘草的主要成分甘草酸，但该法培养周期长，工业化生产比较困难。基于甘草酸的生产和需求现状，可以通过植物内生菌发酵生产甘草酸。

发明内容

针对目前国内外曾试图通过甘草细胞培养技术大量生产甘草的主要成分甘草酸，但该法培养周期长，工业化生产比较困难，没有报道植物内生菌发酵生产甘草酸的现状。本发明提供了从新疆库尔勒地区的紫泥泉甘草自然保护区中筛选出的产生甘草酸的黑曲霉菌株及由此产生的甘草酸。

本发明通过对从新疆库尔勒地区的紫泥泉甘草自然保护区中样本进行微生物菌种的培养、分离，获得一批微生物，并从中分离筛选出一株甘草酸产生菌，编号为B60，从而提供了一株具有生产甘草酸优良特性的产生菌。根据《真菌鉴定手册》，对编号为B60菌株的形态学鉴定、生理生化检测分析确定编号为B60菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)。

同时，本发明还提供了一种甘草酸，通过利用本发明的菌株经过发酵而获得。

本发明具体提供了一种黑曲霉菌株，命名为编号B60，其能够产生甘草酸。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期是2007年12月13日，保藏号是CGMCC No.2289。该菌株的菌落在查氏琼脂上生长迅速，25℃7天直径50-70毫米，中间稍有凸起，有规则的辐射状沟纹；质地丝绒状，分生孢子结构大量，表明呈暗褐黑色至炭黑色；菌落反面无色。分生孢子头初为球形，直径150-500μm；分生孢子梗发生于基质，孢梗茎1500-3500μm×9-20μm，无色透明，壁平滑；顶囊球形或近球形，直径40-70μm，老时带褐色；产孢结构双层；瓶梗8-12×2-3μm；分生孢子球形、近球形，直径3-4.8μm。根据以上的形态特征初步确定菌株编号B60属于黑曲霉属。通过BLAST同源比对，将B60确定为黑曲霉(Aspergillus niger)，该菌种简称为A.niger B60。

本发明建立了菌种筛选、鉴定、保藏、复壮及选育的系统工艺流程技术：

本发明人从新疆库尔勒地区的紫泥泉甘草自然保护区采集甘草植株，将甘草的根、茎、叶，分别用自来水冲洗干净，滤纸吸去水分，用75％的酒精处理，无菌水冲洗，再用0.525％NaOCl处理，无菌水冲洗。消毒滤纸吸干水分，用无菌刀把根、茎、叶片切成小块，把它们置入PDA，LB等固体通用培养基表面，28℃恒温培养，待其切口边缘长出菌后，挑取真菌尖端菌丝转到新的培养基中纯化，细菌菌落进行稀释纯化培养，PDA(真菌)和牛肉膏蛋白胨培养基(细菌)斜面4℃保存。另外把根、茎、叶、树皮用无菌刀切成小块按上面方法处理之后，把无菌水置入PDA等固体培养基表面，28℃恒温培养，以此作为对照。将表面灭菌的根、茎、叶分别剪碎于无菌研钵中，加入无菌水研碎。取0.2mL梯度稀释，涂PDA等培养基平板，恒温28℃培养，PDA(真菌)和LB培养基(细菌)斜面4℃保存。将分离纯化的菌株进行发酵实验，用TLC及HPLC进行检测筛选得到一株可以产甘草酸的菌株-黑曲霉，学名为Aspergillus niger。