[发明专利]一种中和肠出血性大肠杆菌0157：H7志贺毒素Ⅱ的单克隆抗体、Fab抗体与应用

说明书

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，具体说涉及中和肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素II的单克隆抗体、Fab抗体及其应用。 

背景技术

肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7的感染是一个全球性的公共卫生问题。其引发的食物中毒在世界各地均有大规模的暴发流行。2006年在美国爆发的波及26个州的毒菠菜事件就是由该菌污染所致，1999年末至2000年初，在我国东部部分地区发生了迄今为止世界上最大规模的O157:H7感染爆发流行。由于该菌培养容易、感染力强、传播途径多样，使其极有可能作为未来军事斗争的细菌武器和生物恐怖战剂。美国疾病控制中心(CDC)已将EHECO157菌列为B类生物恐怖病原体严加防范。此外，EHEC O157:H7菌的烈性致病因子还有可能用于新型生物武器——基因武器的构建。 

然而目前对其感染尚缺乏有效的防治方法。研究证明：抗生素可促使O157菌释放致死性志贺毒素(Shigatoxin，Stx)，从而使患者病情加重。因此，无论从公共卫生还是生物反恐的需要出发，探索新的治疗手段迫在眉睫。 

研究表明：志贺毒素II(Stx2)是O157:H7主要的致病因子。Stx2进入血液循环后，可引起靶组织器官，如肾小球和结肠内皮细胞的损伤，最终导致溶血性尿毒综合征(HUS)及血栓性血小板减少紫癜(TTP)等严重并发症的发生。Stx2致病是急剧快速的，因此针对Stx2的中和性抗体在O157:H7感染的紧急治疗中将发挥重要作用，但目前国内外尚无Stx2中和性抗体上市。 

由于鼠源单抗可在人体内引起人抗鼠抗体反应；完整的单抗分子量大，组织摄取百分数较低，体内半衰期较长，因而使其在人体内的应用受到限制。基因工程抗体技术的发展使人们可以在基因水平上改造抗体结构，以满足用于人体治疗的抗体需低免疫原性、高特异性、高稳定性、和高亲和力的要求。对鼠源性抗体进行人源化改造，或构建主要保留抗体可变区的小分子抗体，如Fab及ScFv，既可降低分子量亦可降低异源性，同时还保留有抗原结合活性，将有利于鼠单抗在人体内应用。Fab抗体保留了全抗体的轻链和重链的可变区及第一恒定区(VH+CH1)，分子量仅为全抗体的三分之一，大大降低了抗体的鼠原性。与SeFv抗体相比，Fab抗体在体内半衰期较长、稳定性好、保留了与亲代抗体较为接近的亲和力，这对发挥中和毒素作用的治疗性抗体而言尤为重要。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种中和肠出血性大肠O157:H7的志贺毒素II的单克隆抗体，其由保藏在以下单位的杂交瘤细胞株制备：保持单位为中国典型培养物保持中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏日期为2008年5月27日，保藏号为CCTCC：C200822，杂交瘤细胞体系为1F2。 

本发明的另外一个目的是提供上述的单克隆抗体制得的Fab抗体，其包括κ链和Fd链。 

所述的κ链具有SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列或将所述SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换、缺失或添加而仍具有所述氨基酸序列功能的氨基酸序列的任一种。 

所述的κ链的核苷酸序列具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或与所述SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列不同但具有相同编码产物的核苷酸序列中的任一种。 

所述的Fd链具有SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列或将所述SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换、缺失或添加而仍具有所述氨基酸序列功能的氨基酸序列的任一种。 

所述的Fd链的核苷酸序列具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或与所述SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列不同但具有相同编码产物的核苷酸序列中的任一种。 

本发明提供上述的Fab抗体的制备方法，其主要包括以下步骤： 

1)提取所述杂交瘤细胞的总RNA，获得RNA； 

2)以步骤1)中的RNA为克隆模板，克隆所述单克隆抗体的κ链和Fd链基因； 

3)将步骤2)获得的κ链和Fd链基因克隆到T载体中，进行鉴定； 

4)将步骤3)获得的κ链和Fd链基因克隆到分泌表达Fab抗体的载体中，进行表达、鉴定、纯化，得所述的的Fab抗体。 

本发明还提供一种表达载体，其含有上述的κ链和Fd链的核苷酸序列。 

本发明所述的表达载体，可以包括裸DNA或质粒DNA中的至少一种。