[发明专利]一种新的细胞悬浮培养生产重组人促红细胞生成素的方法

说明书

所属技术领域

本发明涉及重组人促红细胞生成素生产过程中的细胞培养方法， 尤其是驯化生产细胞株适应无血清培养，用一次性袋式激流反应器对 细胞进行悬浮培养，提高细胞生长密度，缩短生产周期，降低生产成 本，减少污染，从而高效生产重组人促红细胞生成素。

背景技术

红细胞生成素是一种糖蛋白激素，分子量约34kD。血浆中存在的 促红细胞生成素由165个氨基酸组成，糖基化程度很高，糖基成分主 要是唾液酸。根据碳水化合物含量不同，天然存在的促红细胞生成素 分为两种类型，α型含34％的碳水化合物，β型含26％的碳水化合物。 两种类型在生物学特性、抗原性及临床应用效果上均相同。人类促红 细胞生成素基因位于7号染色体长22区，1985年其cDNA被成功克隆。 红细胞生成素主要由肾小管内皮细胞合成，也可由肝细胞和巨噬细胞 产生。促红细胞生成素是一种强效的造血生成因子，在0.05～1U/ml 时即呈剂量依赖效应。促红细胞生成素活性单一，只作用于骨髓巨核 前体细胞，可刺激红祖细胞及早幼红细胞形成成熟的红细胞集落；对 红细胞造血过程的调节需其他细胞因子(如IL-3、GM-CSF和IL-1等) 的协同作用才能完成。促红细胞生成素的产生受机体内血容量和氧分 压的调节，在失血或低氧的刺激下，促红细胞生成素水平迅速上升。 在某些肿瘤患者，可也现促红细胞生成素异常增高；骨髓造血反应不 良的贫血患者，其促红细胞生成素也升高。重组人促红细胞生成素是 通过基因工程克隆人的重组人促红细胞生成素基因，由CHO细胞发酵 表达的有生物学活性的蛋白，其具有与人体内源性促红细胞生成素相 似的生物学功能。

目前，在培养基应用方面，重组人促红细胞生成素生产细胞株主 要在含有8～10％牛血清的培养基中进行扩增培养，细胞扩增到一定量 后换为无血清培养基进行培养。其中，血清有很多不足的地方，比如：

1.血清的成份可能有几百种之多，目前对其准确的成份、含量及 其作用机制仍不清楚，尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂 类等尚未充分认识，这给纯化工作带来许多困难。

2.血清都是批量生产，各批量之间差异很大，而且血清保存期 只有一年，因此，要保证每批血清的相似性极为困难，从而使生产的 标准化和连续性受到限制。

3.动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其 成分不能保持一致。

4.取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能 导致生产失败或生产结果不可靠性。

5.大规模生产中，血清来源越来越困难，价格昂贵，是构成动 物细胞培养的生产成本的主要部分之一。

无血清培养基质量相对更加稳定，可提高细胞培养和实验结果的 重复性。避免了血清源性污染。可提高产品的表达水平并使细胞产品 易于纯化，目前市面上有很多无血清培养基可供选择。

当细胞在有血清培养基中贴壁生长时细胞必须贴附在基质的表 面上才能生长，一但细胞长成单层，因为细胞间的接触抑制，细胞不 再增殖。这样细胞贴壁生长时的细胞密度取决于贴附基质表面积的大 小，每平方厘米表面积可以容纳1～5×10⁵个细胞，因此，在方瓶和 转瓶培养中，细胞密度一般只能在1～5×10⁶细胞/毫升之间。在采用 了微载体或片状载体的生物反应器中，细胞密度可达1～2×10⁷细胞/ 毫升。

然而，在无血清培养基中，细胞经驯化可以进行悬浮培养，细胞 密度主要取决于培养基的营养程度，因此，理论上讲，只要有足够的 营养，细胞密度可以无限大。目前，对于不同的无血清培养基，细胞 密度可以达到0.5～1×10⁸细胞/毫升之间。

目前，重组人促红细胞生成素生产主要使用的是NBS生物反应器 (或转瓶)，在罐体中加入微载体进行贴壁灌流培养，培养周期在2 个月左右，重组人促红细胞生成素表达量为10mg/L，这种培养方式由 于罐体体积小，微载体量有限，细胞密度较低，重组人促红细胞生成 素表达量低，培养周期较长，生产成本高。

发明内容

本发明中所述的一次性袋式激流反应器是指哈尔滨安普科技发展 有限公司申请的专利《一种细胞悬浮培养罐》(申请号： 200710130135.X)所述相关产品。