[发明专利]浊度法测定杆菌肽及其制剂含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗生素含量的测定方法，尤其是一种浊度法测定杆菌肽及其制剂含量的方法。

背景技术

杆菌肽(Bacitracin)的产生菌为枯草芽孢杆菌(Bacilus subtilis)和苔藓样芽孢杆菌(Bacilus Licheniformis)，系含噻唑环的多肽类多组分抗生素。杆菌肽能抑制细菌细胞壁中主要成分线性肽聚糖链的形成，也影响原生质体、破坏浆膜等，对革兰氏阳性菌有高度的抗菌活性，细菌很少对本品产生获得性耐药性，与新霉素(Neomycin)、多粘菌素B(Polymyxin B)等联合局部应用有协同作用。目前，杆菌肽原料药及其制剂为《中国药典》2005年版二部所收载，其含量测定方法为抗生素微生物检定法之管碟法，其基本原理是利用抗生素在摊布特定试验菌的琼脂培养基内的扩散作用，形成一定浓度的含抗生素的球型区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈，将已知效价的标准溶液和未知效价的供试品溶液在同样条件下进行培养，比较两者抑菌圈大小，在一定的抗生素浓度范围内，对数浓度与抑菌圈直径成正比。

管碟法要严格控制培养时间，防止不适当的培养时间对抑菌圈的清晰度的影响，由于某些抗生素呈抑菌作用，在抑菌圈边缘的菌群只是被抑制，当延长培养时间后，细菌总量增加，使抗生素敏感度下降。抑菌圈边缘的菌群继续生长导致抑菌圈变小和边缘不整齐，如采用枯草芽孢杆菌作为检定菌时，培养时间过长，菌丝向圈内生长，导致边缘不整齐，但采用藤黄微球菌作为检定菌时，在规定的温度和时间培养后，可再置室温和继续培养2-3小时，可使抑菌圈清晰，这可能是抑菌圈边缘菌群继续生长，并产生色素，使抑菌圈边缘致密而显清晰。这样就造成了管碟法在测定抗生素的含量时对时间的掌控要求较高，并且耗时较长。所以采用管碟法测定抗生素如杆菌肽的含量有以下缺点：操作不易掌控、测定结果误差较大、测定速度较慢，使其在工业生产中存在很大的应用局限性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种浊度法测定杆菌肽及其制剂含量的方法，以简单、快速、准确的测定杆菌肽及其制剂含量。

为解决上述技术问题，本发明采用下述方法步骤：(1)、标准品溶液的制备：称取杆菌肽标准品2.5mg，用0.1M盐酸溶液定容至25ml，制成标准品贮备液；取上述标准品贮备液5ml，用灭菌缓冲液定容至50ml，制成标准品中间溶液；用灭菌缓冲液将标准品中间溶液稀释成杆菌肽标准品浓度在0.1ug/ml-0.8ug/ml之间的3-5组溶液，制成标准品系列剂量溶液，其中标准品系列剂量溶液的浓度中含有0.4ug/ml的溶液，其它溶液浓度分散在0.4ug/ml两边；

(2)、供试品溶液的制备：称取杆菌肽样品2.5mg，用水定容至25ml量瓶中，制成样品贮备液；取上述样品贮备液5ml，用灭菌缓冲液定容至50ml，制成样品中间溶液；取样品中间溶液4.0ml，用灭菌缓冲液定容至100ml，制成供试品溶液；

(3)、试验菌悬液的制备：取表皮葡萄球菌斜面培养物，在细菌培养基中培养，稀释后制成试验菌悬液；

(4)、含量测定：上述标准品系列剂量溶液和供试品溶液组成4-6个浓度组，取对应组数的试验管，在各试验管内均加入试验菌悬液9.0ml，再分别加入各浓度的标准品或供试品溶液各1.0ml；在37℃培养3h-4h，用比浊法测量仪在线测定各管在530nm处的吸光度；取2支试验管，其中一支加入pH＝6.0的磷酸盐缓冲液1.0ml和抗生素微生物检定用培养基液体9.0ml，作为同条件培养的溶液的空白；另一支加入pH＝6.0的磷酸盐缓冲液1.0ml和试验菌悬液9.0ml，作为同条件培养的阳性对照；以重复以上操作，作3-5组测定；

(5)、在抗生素比浊法测量仪上在线测量并计算结果即得杆菌肽及其制剂的含量。

本发明也可采用下述方法步骤：(1)、标准品溶液的制备：称取杆菌肽标准品2.5mg，用0.1M盐酸定容至25ml，制成标准品贮备液；量取上述标准品贮备液5ml，用灭菌缓冲液稀定容至25ml量瓶中，制成标准品中间溶液；用灭菌缓冲液将标准品中间溶液稀释成杆菌肽标准品浓度在0.1ug/ml-0.8ug/ml之间的2组溶液，制成标准品高剂量溶液和标准品低剂量溶液；

(2)、称取杆菌肽样品2.5mg，用水定容至25ml，制成样品的贮备液；量取上述贮备液5ml，定容至25ml，制成样品中间溶液；用灭菌缓冲液稀释样品中间溶液，制成与上述标准品溶液浓度相同的供试品高剂量溶液和供试品低剂量溶液；