[发明专利]临床治疗用脐带胎盘间充质干细胞的制备储存和应用

权利要求书

1干细胞制备时正常阴道分娩胎盘，脐带的去污染处理。

a)用无菌生理盐水冲洗胎盘和脐带去除肉眼可见的污物和残留血液。

b)用2％医用碘酒和75％医用酒精，或其它中高强度消毒剂对脐带，胎盘表面处理。

c)根据情况以手工分离，或专用仪器去除0.5mm左右的脐带胎盘外表面。去除过程中外表面不接 触无菌的内侧组织。(图一)

d)以上方法确保包括待处理的胎盘，脐带组织的无菌，和干细胞的最好回收率，并为后期工作减少 需处理的组织量和消化酶的使用量。

e)所储存个体常规进行组织配型(HLA)，生物学，病源微生物检测。同时建立临床用脐带，胎盘间 充质干细胞库的数据库，制备与所储存者的各类细胞，个人资料数据库，和各项报告相一致的数 据卡和条形码。

2根据权利要求1)，间充质干细胞的制备和培养。

a)使用无菌手动，或自动方法处理脐带或胎盘组织至小于1mm大小

b)进一步可使用无菌组织研磨设施处理组织至更小的颗粒

c)室温离心250g 5分钟，弃去上清，收集细胞，用DMEM清洗。再次离心和清洗。

d)常规胶原酶，胰蛋白酶处理组织。

e)常规收集储存第一代和培养后收集第二，三代间充质干细胞。

f)培养采用Dulbecco′s modified eagle′s medium(DMEM，Gibco，USA)，10％自身血清或正常人AB血 清，1％glutamine(Gibco，USA)及无血清培养液

3根据权利要求1)，2)，脐带间充质干细胞的安全储存。

a)脐带间充质干细胞以无菌的方式根据需要收集在无菌的2或5ml细胞储存管中。Corning2mL Vial(430661)，Corning5mL Vial，(430663)，或冷冻袋，Eppendorf等低温冷冻管中。

b)含有干细胞的储存管加密封盖。

c)加盖后的细胞储存管进一步用高质量聚酯膜，EVO共聚物膜，TeflonFEP film或其它适用于

-210摄氏度的双层膜覆盖并用抽空密封法封存各管。每一储存者拥有各自的密封的储存系统。该 各自系统含有与计算机，纸文件档案相一致的封存的条形码和储存者的信息(图二)。在使用冷 冻袋时，同样处理。这些个体干细胞储存系统储存于蒸汽液氮罐的汽相部分。

d)为安全和临床实际需要，备查管分二级保管和待查。一份存于-80度冰箱，另一份存于C项描 述的密封存储系统。(图二)

e)所有经以上方法处理的细胞储存在MVE摄氏-190度高效能蒸汽液氮罐Vapor(MVE 815P-190， MVE 1536P-190，MVE 1879P-190)的汽相中，或其它厂家的摄氏-190度的蒸汽式液氮储存罐的汽 相中。

4根据权利要求1)，对于正常由阴道分娩的脐带，胎盘的去污染处理包括消毒剂的使用和被污染组织的 无菌清除，清除部分为外层0.5mm±。

5根据权利要求2)，脐带，胎盘干细胞培养是在DMEM培养液中进行。用10％自体血清，AB血清或 无血清培养。收集的细胞包括第一代，和培养之后的二，三代。

6根据权利要求3)，安全的细胞储存包括一个密闭的个体储存系统和这一系统的-190度的汽相保存及信 息统一系统。这一个体储存系统包括密闭的细胞储存管，袋，信息卡，二级待查管。

7根据权利要求1-3)这一制备，储存系统也可用于脐带间充质之外的其他细胞，包括脐带血干细胞的制 备和储存。

8根据1-6)，这一专利包括经以上方法处理的干细胞的无菌方法，库，和制备。及其干细胞库和储存方 法可以避免由于液相浸泡所导致的细菌，霉菌等病原体，其他人的细胞，DNA，RNA等的交互污染。 也可避免因所用管盖泄漏引起的对其他储存者干细胞的污染，使储存的干细胞的安全性和将来的临床 应用得以保证。同时大量节省储存空间。进而降低成本。及所致的干细胞的安全临床应用。