[发明专利]可溶性人源含硒单链抗体酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种应用基因工程与化学突变相结合的技术制备谷胱甘肽人源含硒单链抗体酶的方法。

背景技术

含硒的谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的底物是谷胱甘肽(GSH)，催化基团是硒代半胱氨酸(SeCys)。在生物体内，GPX同超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)一起构成了机体抗氧化防御体系。GPX在该体系中发挥着重要的作用，它以GSH为还原剂，分解体内的过氧化氢和各类氢过氧化物，因而能清除体内活性氧(ROS)，防止脂质过氧化，治疗由活性氧引起的各种疾病，如紫外线辐射、心脑血管疾病、白内障、肿瘤等。与其它抗氧化酶不同，GPX除了能清除ROS外，还能降解脂质过氧化物，防止细胞过氧化损伤，这种独特的保护细胞的功能使它在抗氧化酶体系中占有特别重要的位置。然而，由于天然GPX的来源相当有限、稳定性差，致使它的模拟物的研究备受关注。

小分子模拟物主要有PZ51(ebselen)，AL3823A，BXT系列产品，它们的弱点是活力低，仅为天然GPX的千分之一左右。80年代中期出现的抗体酶制备技术为GPX的人工模拟开辟了新途径，根据酶学原理、利用免疫学和化学知识，设计了一种新的产生抗体酶的技术路线，并成功地制备了数种具有很高GPX活力的含硒抗体酶(中国专利94102481.4和96112628.0)。这些高活力的含硒抗体酶氨基酸组成是鼠源的，可作为抗原刺激人体产生人抗鼠抗体，因此限制了该类药物的使用。为了解决这一问题，制备人源含硒单链抗体酶是一个最好的办法，噬菌体人抗体库的成功构建为这一设想提供了可能。

中国专利99104234.4公开的人源单链含硒抗体酶的制备方法是：半抗原-GSH衍生物的设计与合成；以GSH的衍生物为靶抗原直接从噬菌体展示人抗体库中筛选GSH特异的单链抗体；在大肠杆菌中以包涵体形式表达无活性的单链抗体蛋白；变性、复性、纯化单链抗体蛋白；用化学突变(修饰)法将GPX的催化基团SeCys引入单链抗体可变区，因而在单链抗体可变区既有底物结合部位又有催化基团，结果产生具有GPX活力的人源含硒抗体酶。该法制备的人源含硒单链抗体酶的方法有以下缺点：(1)制备过程中表达的包涵体蛋白，是一种无正常空间构象，处于沉淀状态下的无活性蛋白分子，需要经过变性-复性才能有活性。包涵体蛋白复性是一个困难而复杂的过程，仅复性这一步就会损失大量的单链抗体蛋白，导致该法制备抗体酶产率下降；(2)制备抗体酶的周期长、操作繁琐，因包涵体复性是使无活性的蛋白分子在适宜的条件下逐渐恢复活性的缓慢过程；(3)制备的抗体酶活性低，仅为28.8-256U/μmol，低于天然酶一个数量级水平。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种应用标准的抗体库免疫亲和筛选技术、基因工程技术、化学突变技术相结合的方法制备谷胱甘肽人源含硒单链抗体酶的方法，达到提高抗体酶活性、可直接应用于人体、简化步骤、缩短制备周期、提高抗体酶产率的目的。

本发明的总体思路是，先筛选具有GPX底物结合部位的人源单链抗体，通过测序确定其氨基酸序列，然后将编码该氨基酸序列的人源单链抗体基因组装到原核或真核分泌型表达载体上，转化大肠杆菌或酵母细胞，表达可溶性单链抗体蛋白，再用化学突变法将GPX的催化基团引入到单链抗体的底物结合部位；或用基因突变技术和营养缺陷型大肠杆菌直接表达在底物结合部位含有GPX催化基团的可溶性单链抗体蛋白。因而在该单链抗体上既有GPX的底物结合部位，又有催化基团，结果赋予该单链抗体高的GPX的催化活性，就产生了高活力的人源含硒单链抗体酶。

具体制备方法是，利用噬菌体抗体展示技术，以谷胱甘肽衍生物为靶抗原，通过免疫亲和筛选法对重组噬菌体展示人单链抗体库进行筛选。分离并扩增GSH特异性单链抗体基因。将上述基因组装到分泌型原核或真核表达载体上，转化大肠杆菌或酵母细胞，在原核或真核中大量表达并纯化单链抗体蛋白。用苯甲基磺酰氟活化单链抗体中的丝氨酸(Ser)残基上的羟基，再用硒氢化钠处理，则将Ser突变成SeCys，结果在抗体的底物结合部位引入GPX的催化基团SeCys，赋予抗体以GPX的催化活性；或用基因突变技术和营养缺陷型大肠杆菌直接表达在底物结合部位含有GPX催化基团的可溶性单链抗体蛋白，赋予抗体以GPX的催化活性。