[发明专利]可溶性人源含硒单链抗体酶的制备方法

权利要求书

1、一种用于制备人源含硒单链抗体酶的人源单链抗体，其特征是，由15个氨基酸组成的短肽连接，氨基酸序列包括免疫球蛋白的轻链和重链可变区；人源单链抗体B3和人源单链抗体D8的氨基酸序列分别是，

B3的氨基酸序列：

MAQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWVRQAPGQRLEWM50GWINAGNGNTKYS63QKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR100RGAYQNGPANWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGSALSSELTQDPAVSVAL150GQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGS200SSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGHPSVFGGGTKLTVLG245；

D8的氨基酸序列：

MARVQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYTLTYRYLHWVRQAPGQALEWM50GWITPFNGNANYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR100RGAYQNGPANWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGSALSSELTQDPAVSVAL150GQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGS200SSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHVFGGGTKLTVLG244。

2、一种可溶性人源含硒单链抗体酶的制备方法，有人单链抗体的筛选，可溶性单链抗体的表达与纯化，催化基团的引入的过程，其特征是，

所述的人单链抗体的筛选，是以半抗原-S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二酯为靶抗原，通过免疫亲和筛选法对重组噬菌体展示人单链抗体库进行筛选，得到能与谷胱甘肽及其衍生物结合的人源单链抗体B3或D8；

所述的可溶性单链抗体的表达与纯化，是在保持氨基酸序列不变的前提下，根据筛选获得的单链抗体B3或D8的基因序列设计引物；以含有单链抗体基因的噬菌体单链DNA为模板，用引物和聚合酶链反应扩增单链抗体基因；用核酸内切酶切单链抗体基因和分泌型原核表达载体pPELB，通过酶切位点将单链抗体基因组装到pPELB载体上；将含有单链抗体基因的原核表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子；用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达后，单链抗体蛋白以可溶性形式分泌到菌体的周质腔里；收集菌体，低温下超声破碎，离心去除菌体沉淀；用谷胱甘肽亲和层析纯化单链抗体蛋白，透析冻干后即得单链抗体蛋白纯品；再进行催化基团的引入。

3、按照权利要求2所述的可溶性人源含硒单链抗体酶的制备方法，其特征是，所述的引物，是5′端引物加入起始密码子和NcoI酶切位点，3′端引物在终止密码子下游加入NotI酶切位点；或者是5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′和5′-GAATTTTCTGTATGAGG-3′；所述的核酸内切酶是NcoI和NotI。

4、一种可溶性人源含硒单链抗体酶的制备方法，有人单链抗体的筛选，可溶性单链抗体的表达与纯化，催化基团的引入的过程，其特征是，

所述的人单链抗体的筛选，是以半抗原-S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二酯为靶抗原，通过免疫亲和筛选法对重组噬菌体展示人单链抗体库进行筛选，得到能与谷胱甘肽及其衍生物结合的人源单链抗体B3或D8；

所述的可溶性单链抗体的表达与纯化，是在保持氨基酸序列不变的前提下，根据筛选获得的单链抗体B3或D8的基因序列设计引物，5′端引物加入起始密码子和EcoRI酶切位点，3′端引物在终止密码子下游加入NotI酶切位点；以含有阳性单链抗体基因的噬菌体单链DNA为模板，用引物和聚合酶链反应扩增单链抗体基因，用EcoRI和NotI酶切单链抗体基因和分泌型酵母表达载体PIC9K，通过EcoRI/NotI酶切位点，将单链抗体基因组装到PIC9K上；用BglII单酶切，使含有单链抗体基因的表达载体线性化，将含有单链抗体基因的载体转化毕赤酵母感受态细胞，在甲醇诱导下，在毕赤酵母细胞中表达人源单链抗体蛋白，单链抗体蛋白以可溶性形式表达并分泌到培养基里，收集培养上清，浓缩后，用谷胱甘肽亲和层析纯化单链抗体蛋白，透析冻干后即得单链抗体蛋白纯品；再进行催化基团的引入。