[发明专利]重组可溶性溶血链球菌溶血素O基因、重组蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种重组可溶性溶血链球菌溶血素O基因、该基因表达的重组蛋白及其制备方法。

背景技术

溶血链球菌溶菌素O是多种A型、G型和C型溶血链球菌都会分泌的具有溶细胞特征蛋白质。人感染溶血链球菌后机体会产生抗溶血链球菌溶血素O的特异抗体，检测该特异抗体的浓度对临床诊断有很重要的意义；同时溶血链球菌溶血素O由于其具有在含胆固醇的细胞膜上打孔的生物学活性，近年来还广泛的被用于包括癌症治疗在内的多个前沿领域。从天然的溶血链球菌中提纯溶血素O具有很多难以克服的缺点，例如：得率很低；批间差很大；难于工业化生产；存在生物安全隐患等。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可溶性溶血链球菌溶血素O基因、该基因表达的重组蛋白及其制备方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种具有SEQ IDNO：1所示核酸序列的可溶性溶血链球菌溶血素O基因。

本发明运用基因工程技术从溶血链球菌基因组中克隆得到截短的SLO基因，连接到表达载体上再转化入宿主细胞表达纯化大量稳定的r-sSLO蛋白，克服了天然提取的各种缺点，有利于以该蛋白为原材料制备各种试剂的标准化。全长SLO蛋白是含571个AA的60KD左右的蛋白，N端有信号肽用于将成熟蛋白引导至细胞外。研究表明包括信号肽的N端77个AA对宿主细胞有毒害作用，其毒害作用大于其后78-571个AA所产生的溶细胞作用。(其中，SLO为可溶性溶血链球菌溶血素O，r-sSLO为重组可溶性溶血链球菌溶血素O，AA为氨基酸)

一种具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的重组可溶性溶血链球菌溶血素O蛋白。

本发明提供的重组SLO蛋白，即将SLO蛋白的N端77个氨基酸缺失突变，去除信号肽及毒性较大的氨基酸片断，得到具有与天然SLO蛋白相同溶细胞活性的突变体并将其命名为r-sSLO蛋白。

一种制备SEQ ID NO：2所示重组可溶性溶血链球菌溶血素O蛋白的方法，包括下述步骤：(1)从溶血链球菌中分离基因组DNA，用PCR方法得到重组可溶性溶血链球菌溶血素O cDNA；(2)用步骤(1)获得的cDNA序列与表达质粒重组，重组子经过DNA测序验证，确定重组质粒的序列和阅读框均正确；(3)用步骤(2)的表达载体转化表达宿主细胞；(4)培养宿主细胞并从培养基中回收和纯化重组可溶性溶血链球菌溶血素O蛋白。

本发明制备r-sSLO蛋白的方法，包括制备具有生物活性的r-sSLOcDNA基因，将其克隆至表达载体中，转化宿主细胞，诱导培养宿主细胞，以及纯化制备r-sSLO。本发明从溶血链球菌中分离基因组DNA，用PCR方法得到缺失突变的可溶性溶血链球菌溶血素O cDNA，获得的cDNA序列与表达质粒重组，重组子经过DNA测序验证，碱基与阅读框均正确。本发明不限于特定的表达载体，在一优选实施方案中，本发明使用原核表达载体，例如：PET32a(+)。上述重组表达载体按常规方法导入宿主细胞。本发明不限于任何宿主细胞，只要能表达所述基因。在一优选实施方案中，本发明使用大肠杆菌Rosseta gamiII(DE3)，Rosseta gami II(DE3)购于Merck公司，是MerK公司自己对有特殊功能的大肠杆菌产品的命名。本发明的表达产物存在于菌体超破后的上清中，用镍柱可一步纯化得到所需产品。

综上，本发明的有益效果是：本发明运用基因工程技术从溶血链球菌基因组中克隆得到截短的SLO基因，连接到表达载体上再转化入宿主细胞表达纯化大量稳定的r-sSLO蛋白，克服了天然提取的各种缺点，有利于以该蛋白为原材料制备各种试剂的标准化。

具体实施方式

为达到本发明目的，本发明制备r-sSLO蛋白包括如下步骤：

(1)克隆r-sSLO基因、构建表达质粒r-sSLO-PET32a(+)