[发明专利]固定化α-氨基酸酯水解酶及其制备与应用

说明书

发明领域

本发明涉及酶法合成氨基头孢菌素和氨基青霉素的非均相生物催化剂的制备方法。 

技术背景

α-氨基酸酯水解酶(α-amino acid ester hydrolases，AEHs)是一类酶，它们能催化水解α-氨基酸酯和各种头孢菌素和青霉素的酰胺键，也能经α-氨基酸衍生物(酯或酰胺)对7-氨基头孢烷类和6-氨基青霉烷类进行N-酰化反应。相似的底物特点使得这类酶可用于侧链α-位含氨基的头孢菌素和青霉素类(即氨基头孢菌素类和氨基青霉素类)合成的生物催化剂(biocatalysts)。 

对α-氨基酸酯水解酶结构的研究表明，这类酶属于α/β-折叠水解酶，在活性位点上含有丝氨酸-组氨酸-天冬氨酸(Ser-His-Asp)三元催化组合。α-氨基酸酯水解酶在酶的结构、活性位点的组成、底物特点和催化性能方面均不同于β-内酰胺酰化酶(例如青霉素G酰化酶)。β-内酰胺酰化酶在结构上属于N-末端水解酶，β-链的N-末端是活性位点，在催化时扮演亲核剂的作用。 

关于假单胞菌属(Pseudomonadaceae family)菌种产生α-氨基酸酯水解酶类用于α-氨基β-内酰胺抗生素的合成的描述可参见如下文献：Pat.GB1382255(1975)；Takahashi T.，Kato K.，Yamazaki Y.，et al.Jpn.J.Antibiot Suppl.30S：230(1977)；Willner D.，Crast L.B.Pat.CA1044627(1978)；КocгopдC.Γ.，Beйтлaндy.Пaт.RU2136759(1999)；Geun C.T.Jun P.H Pat.KR20010069097(2001)。几种菌产生的α-氨基酸酯水解酶的生化、理化性质和催化性能如下：混浊醋杆菌(Acetobacter turbidans)参见(Ryu Y.W.，Ryu D.D.Y.Enzyme Microb.Technol.9：339(1987))；柑桔黄单孢菌(Xanthomonas citri)参见(Kato K.，Kawahara K.，Takahashi T.et al.Agric.Biol.Chem.44:1069(1980)；Kato K，Kakinuma A.Agric.Biol.Chem.44：1663(1980))；红纹黄单胞菌(Xanthomonas rubrilineans)参见(Кpecтьянoвa И.H.，Увapoв H.H.，PyдeнcкaЯ Γ.H.и дp.Биoxимия55(12)：2226(1990)；Blinkovsky A.M.，Markaryan A.N.Enzyme Microb.Technol.15:965(1993))；对黑色极毛杆菌(Pseudomonas melanogenum)的研究最为广泛(Kim D.J.，Byun S.M.BBA-Protein Struct.&Molecul.Enzymol.1040(1)：12(1990))。这些酶的亚结构已经得到证明。黑色极毛杆菌(Pseudomonas melanogenum)产生的酶由两个分子量为70000-72000的亚基组成，混浊醋杆菌、柑桔黄单孢菌和红纹黄单胞菌产生的酶则由四个具有类似分子质量的亚基构成。不同来源的α一氨基酸酯水解酶在生化和催化性能上是相似的。已经确定柑桔黄单孢菌和混浊醋杆菌产生的酶的晶体结构以及酶活性位点的组成，并已克隆出酶的基因：柑桔黄单孢菌见[Laan Van Der M.，Polderman-Tijmes JJ.，Barends T.R.M.Int.Pat.Appl.WO02086111(2002)；Barends T.R.M.，Polderman-Tijmes J.J.，Jekel P.A.et al.J.Biol.Chem.278：23076(2003)；Okubo A，Nagaoka T.，Yokota S.et al.Iht.Pat.Appl.WO02086127(2002)]；混浊醋杆菌见[Laan Van Der M.，Polderman-TijmesJ.J.，Barends T.R.M.Int.Pat.Appl.WO02086111(2002)；Polderman-TijmesJ.J.，Jekel PA.，Jeronimus-Stratingh C.M.et al.J.Biol.Chem.277：28474(2002)]。