[发明专利]抑制肝癌细胞生长的发酵液的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的制备方法，具体地，涉及一种抑制肝癌细胞生长的发酵液的制备方法。

背景技术

肝癌是全世界死亡率很高的疾病，一般的治疗方法是采用手术切除，但许多病例中多为中心发生，极易发生癌细胞的早期转移，这种病情限制了手术切除的应用。因此需要一些药物的辅助治疗，但是现有药物对肝癌病人进行的全身化疗效果较差，因此寻找新的有效化学治疗药物对提高晚期和复发肝癌病人的生存率具有重大意义。

植物内生真菌是一类生存在宿主植物茎叶内并完成其生活周期的真菌，在演化过程中二者形成了稳定的生态关系。内生真菌的代谢物能刺激植物生长发育，提高寄主植物对生物和非生物胁迫的抵抗能力，特别是内生真菌往往能与植物相互作用，产生相同或相似的代谢产物。考虑到微生物具有繁殖迅速，容易培养，生物量大等特点，研究从药用植物中分离内生真菌，获得产药用物质的内生真菌，将是一种很有潜力的药物来源。

胡桃楸(Juglans mandshurica Maxim)是胡桃科胡桃属的落叶乔木，主要分布于我国黑龙江省东部小兴安岭、完达山以及张广才岭等山区，为我国珍贵树种之一。楸树中含有丰富的环烯醚萜类化合物，不仅有利尿、降血糖及迟缓和泻下作用，还有抗炎、抗氧化、神经保护作用；胡桃楸有抗肿瘤活性，有可能作为有效的端粒酶活性抑制剂。胡桃楸提取液是通过诱导细胞凋亡从而起到抗肿瘤作用的。胡桃楸的抗肿瘤研究预示其内生真菌也可能具有产抗癌物质的能力。然而，目前还没有从胡桃楸中分离出具有抗肿瘤效果的内生真菌的报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种抑制肝癌细胞生长的发酵液的制备方法。本发明利用从胡桃楸树皮部分离纯化得到纯的内生真菌菌株，并通过传统的形态学方法，发酵方法进行鉴定，适合工业规模化发酵生产具有抑制人肝癌细胞株HepG2生长的作用且高效低毒的发酵液。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明菌株的获得：本发明所使用的楸树内生真菌菌株由胡桃楸树皮中分离制得。分离方法为：取胡桃楸树皮刮去浮皮，灭菌后削去表层，切取组织小块，置于水琼脂固体平板培养基上，放入培养箱培养；取切口处新长出的菌丝，转接至培养基上培养，待菌落长出后，根据菌落形态、颜色的差异以及长出时间的不同，分别挑取各平板上菌落边缘处的菌丝接于新的培养基平板上进行分离培养；从中筛选出具有抗肿瘤活性的内生真菌，经鉴定为半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，木霉菌属长枝木霉(Trichoderima longibrachiatum)，现保存在中国典型培养物保藏中心，保存编号为：CCTCC M 208102。

本发明包括以下步骤：

第一步、内生真菌的分离：分离内生真菌并且采用菌丝尖端切割法进行纯化；

第二步、诱导孢子产生：将长枝木霉CCTCC M 208102接种到马铃薯-琼脂培养基(PDA培养基)上培养，将长有菌丝的PDA培养基切下一小块，放于CMX培养基(Leach，Lang and Yoder，1982.Journal of General Microbiology，128：1719-1729中公开)上，室温下培养，1到3天后有孢子长出；

第三步、液体发酵培养：挑取孢子转接到装有CM液体培养基(Leach，Langand Yoder，1982.Journal of General Microbiology，128：1719-1729中公开)中，26℃到28℃，180rpm摇床振荡培养，7～8天后中止发酵，即得具有抑制肝癌细胞生长作用的发酵液。

所述第一步中分离内生真菌的方法如下：取胡桃楸树皮刮去浮皮，使用自来水冲洗20分钟后置于无菌超净工作台，用无菌水冲洗3到4遍，再用体积百分比为75％的酒精浸泡3到5分钟，然后用质量百分比为1％的NaClO溶液灭菌20分钟，再使用无菌水反复洗涤4到5遍，用无菌纸吸干树皮上的无菌水，削去黑色表层，切取0.5cm³的小块，置于水琼脂固体平板培养基上，放入25℃培养箱培养。

所述第一步中的纯化方法如下：取切口处新长出的菌丝，及时转接至新鲜的PDA培养基上培养，待菌落长出后，根据菌落形态、颜色的差异以及长出时间的不同，分别挑取各平板上菌落边缘处的菌丝接于新的PDA平板上进行分离培养，然后切取培养菌丝的尖端，移入一新的培养基上培养，切割3到5次即可得到纯化的菌株。

所述第二步中PDA培养基组成为：200g新鲜土豆煮的汁，20g葡萄糖，固体培养基加1.5％琼脂，加蒸馏水至总体积为1000ml。