[发明专利]一种脱氧核苷三磷酸的分离提纯方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及生物化工领域，具体地说，是一种广泛使用的脱氧核苷三磷 酸(dNTP)酶法合成产品的分离提纯方法。

【背景技术】

通常对脱氧核苷单磷酸(dNMP)合成脱氧核苷三磷酸(dNTP)的生物合成反 应液，采用沉降操作使生成的dNTP以钡盐的形式被分离出来，如用溴化钡水 溶液使dNTP从反应液中分离出来的沉降分离、再使用离子交换树脂洗脱 dNTP，使其成为dNTP水溶液的反复沉降洗脱的分离提纯方式，或者将dNTP 的生物合成反应液直接用离子交换树脂填充柱洗脱，再用高压液相色谱分离 提纯的方法手段。

现有对dNTP的生物合成反应液分离提纯的方法，获得高纯度的dNTP产 品(含量在98％以上)必需使用液相色谱进行分离，分离速度慢，流动相溶 剂耗用量大，无法满足大批量工业化生产的需要，而且由于使用毒性重金属 离子水溶液以及离子交换树脂，相应需要非常大量的水溶液对它们的使用进 行处理，这些处理势必带来严重的水资源污染和水处理工艺机器运转的高能 耗等，以上技术方法是造成dNTP产品非常高昂价格的重要原因。

脱氧核苷三磷酸(dNTP)包括四种组分：脱氧核苷三磷酸(dNTP)产品包括 脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)和 脱氧胸苷三磷酸(dTTP)。dNTP是DNA生物合成过程中必不可缺的中间体， 它具有商业性，但是价格非常昂贵，如美国SIGMA公司dATP的价格高达 250.5美元/100mg(含量97％以上，2006～2007价格目录)。目前市场上存在 的dNTP生产方法主要有化学合成法以及酶合成法；与化学法相比，酶合成法 可降低可观的成本，有着更好的经济性以及环保性。dNTP的合成需要两个酶 的磷酸化反应，即从脱氧核苷单磷酸盐dNMP转化为脱氧核苷二磷酸dNDP， 进而再转化为dNTP的过程。20世纪80年代，美国著名的科学家Whitesides 成功开发了四种dNTP中的一种dATP的酶合成法，将1-mmol以下规模的 dATP生产扩展到了200-mmol的大批量生产；他们将dATP从生物合成反应 混合液中以其钡盐形式离析出来，初步提纯可达到60％的纯度；进一步用离 子交换树脂进行洗脱提纯可使dATP达到95％的纯度。高纯度的dATP(含量 在98％以上)对cDNA合成、测序和标记等反应的成功非常重要，但是高纯 度产品的获得通常需要用高压液相色谱进行操作，耗时费力，液料使用排放 量大，污染严重。dATP产品的分离提纯长期以来是一个瓶颈问题，如何使合 成制造的途径更方便更经济，使其用于DNA合成以及其它生物材料合成，成 为长期以来人们研究的热点。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种脱氧核苷三磷酸的分 离提纯方法，可避免使用毒性金属离子水溶液和离子交换树脂，以及由此带 来的大量的水处理工艺缺陷，从而降低生产成本，减少环境污染。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种脱氧核苷三磷酸的分离提纯方法，其包含对脱氧核苷三磷酸产品中 的脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸和脱氧胸苷三磷酸的 分离提纯方法，其步骤为，

(1)首先，在温度为4℃以下时，将脱氧核苷三磷酸生物合成反应液直 接用有机溶剂沉降，脱氧核苷三磷酸生物合成反应液与有机溶剂的体积比为 1∶1～1∶25，优选为1∶4～1∶15，得到脱氧核苷三磷酸的固形混合物；

(2)其次，在温度为4℃以下时，将步骤(1)得到的固形混合物用超纯 水溶解，用盐酸酸性水溶液调整pH值为0.1～2，优选为0.5～1.5，再用有机溶 剂沉降，得到纯度95％以上的脱氧核苷三磷酸固形物；然后再将该固形物用 少量超纯水溶解，再用氢氧化钠碱性水溶液调整pH值为5～11，优选为7.0～9.0， 液氮冷冻并进行冷冻干燥，得到脱氧核苷三磷酸钠盐产品；

所述的有机溶剂为无水乙醇或者异丙醇中的一种，优选为无水乙醇。

本发明一种脱氧核苷三磷酸的分离提纯方法的积极效果是：

(1)本发明避免使用了毒性的钡盐水溶液沉降dNTP生物合成反应液， 并且避免使用离子交换树脂分离提纯，从而避免由这些操作所带来的水处理 工艺高能耗的缺陷；