[发明专利]多氧霉素B的定量分析检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种药物技术领域的检测方法，具体地，涉及一种多氧霉素B的定量分析检测方法。

背景技术

多氧霉素(polyoxin)是由日本理化研究所为首的科研机构开发、并于1967年获登记的农用抗生素。从可可链霉菌阿苏变种(Streptomyces cacaoi var.asoensis)发酵产生的多氧霉素主要为两种成分：多氧霉素A和多氧霉素B，但多氧霉素A几乎没有活性；而其B成分即多氧霉素B(polyoxin B)是一类广谱的抗真菌农用抗生素，由于它是一种高效、低毒、无环境污染的安全农药，所以被广泛应用于粮食作物、特用作物、水果和蔬菜等重要病害的防治。在抗生素发酵过程中产物检测方法的建立是至关重要的环节。

目前已报道的多氧霉素B的检测方法主要为HPLC法(孙忠松，刘刚，牛增元，马昕，用液相色谱二极管阵列检测器测定多氧霉素B，化学分析计量，1999年，第8卷，第3期)。这种方法结果准确，但传统HPLC方法价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多，而且前期处理步骤多、过程复杂、分析时间长，在发酵生产中不便于对高产菌株进行大量初筛以及对发酵过程中的产物进行动态监控。

抗生素的生物鉴定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点。牛津杯法是琼脂扩散法中的一种，其原理为：①利用抗生素在摊布的含有特定试验菌的琼脂培养基内进行球型立体扩散；②形成一定浓度的含有抗生素的肉眼可观察到透明抑制圈，抑制了试验菌的繁殖；③抗生素的浓度不同，抑菌圈的大小也不同，比较供试品与样品的抑菌圈直径，可得供试品含量。然而在多氧霉素B发酵过程的动态监控中，至今还未见有关生物检测方面的报道。由于在整个生物检测过程中影响实验结果的因素很多，如检测平板的厚度、培养的温度、牛津杯的加液量以及菌悬液的浓度等，其中一个环节操作不当或因素被忽略，就有可能导致该检测方法的失败。因此如何建立起一套直观、准确、快速、测试简单并且费用低廉的定量分析检测方法成为目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种多氧霉素B的定量分析检测方法。本发明对于多氧霉素B的检测方法可以应用于多氧霉素B工业发酵生产中，包括在高产菌株的初筛阶段以及对发酵产物进行动态监控。与背景技术中使用HPLC方法对多氧霉素B进行检测的方法相比，具有灵敏、快捷、操作简单、原料价廉且相关性好的特点。

本发明是通过以下技术方案实现的：

(1)确立牛津杯法测定多氧霉素B的生物检测条件：平板厚度为底层培养基20mL，上层培养基5mL；培养温度为30-32℃；牛津杯的加液量为200μL；加菌层培养基的菌悬液浓度为5×10⁶cfu/ml；

(2)标准曲线的建立：在步骤(1)的生物检测条件下，取多氧霉素B的标品和样品溶于缓冲液中，用牛津杯法测定在不同浓度时抑菌圈的直径大小，并用抑菌圈直径为横坐标，多氧霉素B浓度的对数值为纵坐标，绘制标准曲线；

(3)产多氧霉素B菌株的摇瓶发酵及发酵液的后处理：将产多氧霉素B的菌株的孢子在固体培养基上培养至孢子成熟，然后将成熟孢子接种于种子培养基中，摇瓶培养后再将活化的种子接种到发酵培养基中培养并取样，最后将发酵液离心并用氯仿抽提；

(4)牛津杯法测定发酵液中多氧霉素B的含量，步骤包括：在平板上加20mL底层培养基和5mL加菌层培养基，在加有底层和加菌层培养基的平板上放置牛津杯，然后将步骤(3)中所述经氯仿抽提处理后的发酵液滴加到牛津杯中，其中牛津杯的加样量为200μL，随后将滴加抗生素的平板放入培养箱中在30-32℃下进行培养，最后用游标卡尺测量抑菌圈的直径，根据标准曲线测得多氧霉素B在发酵液中的含量。

本发明通过确定用牛津杯法检测多氧霉素B方法的最佳生物检测条件，并用多氧霉素B的标准溶液在此最佳生物检测条件下绘制一条线性回归曲线，然后利用牛津杯鉴定各阶段的发酵液所产生的抑菌圈大小，利用线性回归曲线测得多氧霉素B在发酵液中的含量。