[发明专利]一种结合荧光定量PCR的基因分型检测方法

说明书

一.技术领域

本发明属于基因检测方法，具体地说涉及一种结合荧光定量PCR进行基因分型检测的方法。

二.背景技术

聚合酶链式反应(PCR)可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量分析。其原理是在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。

一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值(threshold value)。

实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。

非探针类常用的染料是SYBR Green I。SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

我们利用SYBR Green I染料法可以在反应末尾对扩增产物进行熔解曲线分析。在熔解曲线分析过程中，随着温度从低于产物熔解点缓慢升到高于产物熔解点，定量PCR仪连续监测每个样品的荧光值。基于产物长度和G/C含量的不同，扩增产物会在不同的温度点解链。随着产物的解链就可以看到荧光值的降低并被仪器所测量。熔解曲线分析可用于产物的分析鉴定，同时避免了耗时的电泳。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指基因组水平上由单个碱基变异引起的DNA多态性，在人群中的发生频率大于1％，它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。组成DNA的碱基虽然有4种，但SNP一般只有两种碱基组成，所以它是一种二态的标记，即二等位基因(biallelic)。由于SNP的二态性，非此即彼，在基因组筛选中SNP往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度，这就利于发展自动化技术筛选或检测SNP。

目前已建立的SNP分型方法很多。包括传统的PCR-RFLP、PCR一单链构象多态性(single-strand eonformation polymorphism，SSCP)、等位基因特异性PCR(allele specific PCR，AS-PCR)和直接测序.以及近几年发展起来的变性高效液相色谱(denaturing highperformance liquid chromatography，DHPLC)、基质辅助激光解吸飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOFMS)、动态等位基因特异性杂交(dvnamic allele specific hybridization DASH)和DNA芯片等技术。尽管这些新方法具有通量高、易于自动化等优点，但其极高的成本和昂贵的仪器设备是许多中、小型实验室所无法承担的。