[发明专利]一种酶催化电导免疫传感器及其检测食源性病原体的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物分析领域，具体涉及一种基于微间隙阵列电极的免疫传感器，以及利用该免疫传感器检测食品中食源性病原体的方法。

背景技术

食源性病原体是指以食物为载体、导致人类发生疾病的一大类细菌与病毒。近年来，全球食品安全事件频频发生，如美国的“李斯特氏杆菌事件”、日本的“大肠杆菌O157流行事件”等，对人类健康带来很大危害，引起各国政府的全力关注。传统的检测方法(如分离培养、生化鉴定等)无法对难培养或不可培养的致病菌进行检测，而且特异性不高、灵敏度低、操作烦琐耗时，不能实现有效的监测、预防作用。因此，发展新的快速检测与鉴定食源性病原体的方法是及时有效地控制和预防致病菌、病毒传播的前提。

发明内容

本发明的目的在于克服传统食源性病原体检测技术灵敏度低、特异性不高及操作繁琐耗时等不足，提出了一种酶催化电导免疫传感器及其检测食源性致病菌的方法，具有灵敏度高、特异性好、快速、低成本的特点。

本发明的技术方案之一是，用于检测食源性病原体的所述酶催化电导免疫传感器采用以下步骤制得：

1、取常规光刻印刷法制作的微间隙阵列金电极做基片，它为叉指式双电极，正负电极均为两个梳形金电极，彼此交叉组成微间隙阵列金电极。梳形齿D₁宽为1μm-100μm，间隙D₂为1μm-100μm(参见图1)；

2、将所述微间隙阵列金电极进行硅烷化处理，过程是：

a.将所述微间隙阵列金电极用无水乙醇清洗三次，每次0.8min-1.2min，

b.将该微间隙阵列金电极浸入1M的NaOH溶液中28min-32min；然后超纯水清洗该微间隙阵列金电极三次，每次0.8min-1.2min，吹干；

c.将所述微间隙阵列金电极浸入含氨丙基三甲氧基硅烷5％(体积百分数)的乙醇溶液中，室温下静置23小时-25小时；再用超纯水清洗三次后吹干，即得硅烷化的微间隙阵列金电极；

以上过程可在微间隙阵列金电极间的基片上形成一氨基硅烷自组装单层。

3、免疫传感器的制备步骤：

a.将所述硅烷化的微间隙阵列金电极浸入质量分数为5％的戊二醛水溶液中，室温下静置1小时；

b.取出，用超纯水清洗三次；在所述电极上滴加30μL食源性病原体的单克隆抗体溶液，室温下静置反应1小时；所述单克隆抗体溶液的抗体浓度为100μg/mL，该溶液系将所述单克隆抗体溶于0.01M、pH 7.4磷酸缓冲溶液而得；这样使得抗体通过戊二醛交联剂固定在微间隙阵列金电极的基片上；

c.用超纯水清洗三次，吹干，得到酶催化电导免疫传感器；保存于4℃备用。

本发明的技术方案之二是，采用所述酶催化电导免疫传感器检测食源性致病菌的方法采用以下步骤实现：

1.将分析物样品或标样溶液、待测病原体的单抗溶液各20μL混合后滴加在所述酶催化电导免疫传感器上，室温下静置反应0.4小时-0.6小时；所述分析物样品或标样溶液系将所述分析物样品或标样溶于0.01M、pH 7.4磷酸缓冲溶液而得，所述待测致病菌的单抗溶液系将所述待测致病菌的单抗体溶于0.01M、pH 7.4磷酸缓冲溶液而得；

由此通过样品中的分析物将两种单抗连接起来，在传感器表面形成单抗-分析物-单抗的夹心免疫复合物；

2.在所述传感器表面滴加20μL碱性磷酸酶标记的第二抗体溶液(即碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG抗体溶液，亦即酶标二抗)，于室温下静置反应0.45小时-0.55小时；所述第二抗体溶液是将溶碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG抗体溶于0.01M、pH 7.4磷酸缓冲溶液而得；溶液中抗体浓度为10μg/mL；

此过程中，酶标二抗通过与免疫复合物中的单抗发生反应而被捕获到传感器表面上；

3.将所述传感器置于银沉积溶液中，室温下静置反应8min-12min；再由该传感器获取与分析物浓度成负相关的电导或电阻信号；所述银沉积溶液系将1mM抗坏血酸磷酸酯、2mM AgNO₃溶于0.1M甘氨酸-NaOH缓冲溶液而得，溶液pH9.0。

所述分析物与待测物为沙门氏菌或大肠杆菌O157:H7等食源性病原体。

该步骤中，传感器表面上碱性磷酸酶催化其底物抗坏血酸磷酸酯水解产生还原剂抗坏血酸，后者将溶液中银离子还原成银金属并沉积在微间隙阵列金电极上，使微间隙阵列金电极正负电极部分导通，从而增大微间隙阵列金电极的电导(或降低电阻)，获得与分析物浓度相关的电导(或电阻)信号。