[发明专利]一种制备脱细胞基质的方法

说明书

技术领域

本发明属于组织工程领域，具体地说是涉及一种制备脱细胞基质的方法。

背景技术

来源于脱细胞基质的各种生物支架材料，在动物实验的临床前研究和人种疾病的临床应用中，已经取得了成功。通过去除各种组织器官中异种或同种异体细胞，保留其中复杂的结构和功能蛋白，即可得到相应组织器官的脱细胞基质。不同的脱细胞方法直接影响所得脱细胞基质的成分和超微结构，最终影响移植后宿主对脱细胞基质的反应。

现行脱细胞基质的制备方法主要包括：1物理法；2化学法；3酶法。物理法指的是通过冷冻，高压，超声波，渗透压改变等物理方式破坏细胞，其优点在于得到的脱细胞基质没有其他外加成分的残留，但这种方法的最大缺点是：在破坏细胞的同时也不同程度的破坏了细胞外基质的超微结构，同时破裂的细胞碎片一定要通过其他方式予以清除，这种清除过程会进一步破坏细胞外基质的超微结构。化学法包括使用某些酸、碱、表面活性剂等化学方法裂解细胞。这种方法其优点在于脱细胞过程短，速度快，但这种方法同样会破坏细胞外基质的超微结构，并且还会造成某些基质成分(如蛋白多糖)的丢失。酶法主要使用各种蛋白酶(如胰蛋白酶，中性蛋白酶)核酸酶(核酸外切酶，核酸内切酶)，通过水解细胞蛋白成分和核酸成分达到破坏细胞的目的。蛋白酶可以有效地去除细胞成分，但由于胰蛋白酶和中性蛋白酶的作用底物比较广泛，造成细胞外基质中的结构和功能蛋白大量降解。核酸酶选择性的降解核酸，不会造成细胞外基质成分的破坏，但其分子量过大，极易引起免疫反应。

在组织工程中良好的支架材料应具有以下技术要求：①良好的生物相容性，自身及其降解产物对机体无毒性，不引起排斥反应和炎性反应，不致突变、畸变；②材料携带具有生物诱导性的多种细胞生长因子，诱导自体细胞生长繁殖；③支架材料的降解速率与植入脱细胞基质的细胞形成组织器官的速率相匹配。在支架完成其功能后可被完全吸收或与新生的组织融合；④可按各组织的特点和缺损情况进行塑形，达到完善修复；⑤具有一定的韧性和可加工性，能形成三维立体结构，为细胞进行物质代谢提供足够空间。现有研究表明利用脱细胞基质作为组织工程的支架材料具有来源广泛，可降解，有良好的生物相容性的特点，特别是材料可预先按修复组织大小和厚薄设计，更适于各种组织病变的修复重建。因此，如何获得具有以上5项技术要求的脱细胞基质成为组织工程亟待解决的重大课题。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种制备脱细胞基质的方法，该方法可制备到具有较好物理学性状和生物学功能的脱细胞基质。

解决上述技术问题的技术方案如下：

一种制备脱细胞基质的方法，包括以下步骤：

a.将待用组织器官预处理；

b.将经过预处理的待用组织器官加入到包含有磷脂酶的溶液中，通过低渗或等渗液浸泡制备脱细胞基质，其中，磷脂酶的浓度小于10000U/ml；

c.洗涤制备的脱细胞基质

本发明一种利用磷脂酶制备脱细胞基质的方法的技术方案是选择专一性更强的包含有磷脂酶的溶液特异性水解待用组织器官中细胞的磷脂成分，达到脱去细胞而不损伤细胞外基质的目的。同时也可以辅以化学法，使用对细胞外基质成分影响很小的一种或一种以上表面活性剂，以加快磷脂酶的脱细胞作用。另外，根据各种组织的脱细胞要求的不同，可以再辅以物理方法进一步加快磷脂酶的脱细胞速度。

所述的待用组织器官包含有异种或同种异体或自体组织器官。可为皮肤，心瓣膜、血管、膀胱、韧带、软骨、神经中的任一种，也可以为角膜、巩膜、结膜中的任一种或其任意组合体。

所述的预处理指的是使用包含抗生素的生理缓冲液对待用组织器官进行常规清洗、消毒、分离。还可以包括低渗或等渗浸泡，震荡，调节洗涤温度，适当频率和强度的超声波处理

所述的磷脂酶包含有磷脂酶A₁，A₂，B₁，B₂，C，D中的任一种或一种以上。。

所述的磷脂酶的浓度范围小于10000U/ml，优选1-1000U/ml。含有磷脂酶溶液的温度范围为0-56℃，含有磷脂酶溶液的pH值范围为5-12。

在利用低渗或等渗浸泡，震荡时，可以调节反应温度，适当频率和强度的超声波处理等物理方法进一步加快磷脂酶的脱细胞速度。

所述的表面活性剂指的是生物体内可以生成的具有表面活性作用的成分，或指的是人体内可以生成的具有表面活性作用的成分。