[发明专利]猪糖基磷脂酰肌醇锚1蛋白编码基因GPI1作为猪抗病育种遗传标记的应用

说明书

技术领域

本发明涉及猪的分子生物学技术及育种领域，具体涉及与肠毒素大肠杆菌(ETEC)F4 ad受体相关的猪糖基磷脂酰肌醇锚1蛋白编码基因GPI 1的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，缩写为SNP)的检测方法。

背景技术

在猪病中，仔猪泻痢是最普遍而重要的疾病，由腹泻使仔猪的死亡率达11.5％-29.5％，其中大肠埃希氏菌(Escherichia coli简称E.coli)引起的发病率和死亡率占整个发病率与死亡率的56.2％和24.7％，值得一提的是致病性E.coli的抗原特性是可变的，已发现的E.coli菌体(O)抗原血清型就有100多种，给研制疫苗及药物治疗带来很大困难，因此，从根本上开展猪对肠毒素大肠杆菌病抗性遗传机制研究，进行抗病育种，已引起国内外学者的重视。

肠毒素大肠杆菌(ETEC)是引起仔猪泻痢的主要病原体之一，它可引起仔猪黄痢、仔猪白痢、猪水肿病等多种大肠杆菌病。ETEC与共生性非致病性大肠杆菌不同，其致病性决定于它们在宿主小肠上皮细胞上的定居能力和产生肠毒素的能力，两者缺一不可。ETEC定居宿主小肠上皮细胞能力是由菌体表面的特异菌毛介导的，这种ETEC特异菌毛通常称为定居因子或粘附素。

在引起仔猪泻痢的ETEC中，已发现的粘附素有K88(F4)、K99(F5)、F17、F18等多种，其中初生仔猪腹泻是由F4引起的。这些粘附素要在小肠粘膜附着，还必须在小肠粘膜上皮细胞刷状缘有特异性受体，不同猪只肠粘膜有无特异性受体是由基因控制的，无受体的猪在受到细菌感染时不发病，表现为抗性，因此寻找和筛选该受体的遗传标记是培育出抗性猪的重要途径。

发明内容

本发明的目的是采用δ差异显示法筛选F4 ad受体的相关基因；

本发明的另一个目的是筛选与黏附性(受体有无)相关的SNP，以期应用于标记辅助选择或标记辅助渗入。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下步骤：

(1)分别采集不同品种初生仔猪的小肠，采用体外黏附测定检测各样品的黏附性；

(2)提取小肠上皮细胞总RNA，并将之反转录成cDNA；

(3)利用δ差异显示引物实施差异PCR，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法显示PCR产物；

(4)将差异带回收后再PCR扩增，以增加差异DNA数量；

(5)Northern blot鉴定阳性差异带；

(6)将阳性差异带克隆并测序后，将序列进行数据库同源性分析；

(7)根据测序结果和序列分析结果，筛选与受体有关的基因；

(8)根据相关基因的序列设计引物，对样品进行扩增、测序；

(9)筛选与黏附性(受体有无)相关的SNP。

本发明采用PCR与DNA测序结合的方法首先筛选出GPI 1基因为F4 ad受体的相关基因，继而从猪GPI 1基因上筛选到与受体相关的SNP，并且通过生产实践验证确定GPI 1基因为F4 ad受体相关基因，筛选的SNP为与F4ad受体相关的SNP。本发明筛选的猪GPI 1基因的SNP可作为猪抗病育种辅助选择的遗传标记，从而培育出抗性猪，具有极其重大的应用价值和经济效益。

本发明的内容结合以下实施例作更进一步的说明，但本发明的内容不仅限于实施例中所涉及的内容。

附图说明

图1为实施例的技术路线图；

图2为显微镜下的黏附型的黏附情况图(X 1000)；

图3为显微镜下的不黏附型的黏附情况图(X 1000)；

图4为δ差异片段电泳图；

其中，R为不黏附型，S为黏附型，M为100bp DNA ladder，箭头所示为差异片段；

图5为Northern杂交图；

其中，R为无受体，S为有受体；

图6为F4ad受体差异带9序列的BLAST结果图；

图7为F4ad受体差异带4序列的BLAST结果图；

图8为引物2扩增的GPI 1基因序列同源比对结果图；

图9为引物2扩增的GPI 1基因序列同源比对结果图；

其中，a3、a5、a6、b7为有受体个体，c6、c9、a8、b8为无受体个体，箭头处显示的是突变位点。

具体实施方式