[发明专利]一种蜡状芽孢杆菌CPU0029菌株及用它制备石斛类生物碱的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体是涉及一种石斛内生细菌(蜡状芽孢杆菌CPU0029菌株)，以及用该菌生产石斛类生物碱的方法。

技术背景

植物内生菌(Plant endophyte)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物，而被感染的宿主植物(至少是暂时)并不表现出外在病症。既包括互惠共利的和中性的内共生微生物，也包括那些潜伏在宿主体内的病原微生物，这些微生物有细菌、真菌、放线菌等。

近些年来，植物内生菌由于能够产生丰富多样的具有多种生物活性的次生代谢产物，在自然界中具有重要的生态学作用，受到了全世界的广泛关注并取得了极大进展。植物内生菌能够产生植物生长调节类物质，杀虫抗菌物质，抗肿瘤类物质，及其他类型的代谢产物，如一些内生真菌能产生细胞壁分解酶，用以克服宿主防御异物的天然屏障，还能产生果胶酶、纤维素酶、酯酶等胞外酶。由于内生菌和宿主植物的共生(或寄生)，其次生代谢产物往往有特殊的生物活性。人们发现有的内生菌能够产生与宿主(尤其是药用植物)相同或类似的化合物，如从南方红豆杉树皮中分离到的能够产生紫杉醇的内生真菌，从长春花、桃儿七等植株中分离到产长春新碱和鬼臼毒素类似物的内生真菌，从华重楼中分离到能够产生重楼甾体皂甙的内生细菌，在德国鸢尾根状茎中分离得到产鸢尾酮的丝状真菌等。这就为植物药物的生产提供了新的途径，并且对珍贵稀有药用植物的保护和开发有着积极作用。

石斛(Dendrobium nobile Lindl)是中国传统中药，应用历史悠久。现代药理研究表明，石斛具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、扩张血管及抗血小板凝集等作用，因此在临床上及中药复方中被广泛应用。由于多年来的掠夺性采挖和无序开发，野生石斛已经濒临灭绝，寻找新的、可再生的石斛替代资源成为必然。

发明内容

本发明的目的是提供一株从新鲜石斛外植体中筛选分离得到内生菌，该菌能产生与石斛相同的有生物活性的次生代谢产物，本发明还提供了用该菌生产石斛生物碱的方法。

所说的石斛内生细菌，是蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)CPU0029，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M208020。

所说的用蜡状芽孢杆菌CCTCC M208020生产石斛类生物碱的方法，包括以下步骤是：

(1)发酵培养：以PDA培养基为种子培养基，改良PDA培养基为发酵培养基对蜡状芽孢杆菌CPU0029 CCTCC M208020进行发酵；

(2)分离纯化：将发酵液上清碱化后过滤，经氯仿或乙酸乙酯萃取，回收有机溶剂得到浸膏。

为了减少萃取时有机溶剂的用量，还可以在萃取前将滤液经过大孔树脂富集后，将洗脱液浓缩后再碱化。

得到的浸膏产物还可再经硅胶柱层析进一步纯化。

蜡状芽孢杆菌CPU0029 CCTCC M208020能够利用多种有机碳源，如葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉等，但不能利用枸橼酸盐；该菌也能够利用多种有机氮源，如蛋白胨、酵母粉、玉米浆、牛肉膏等(除尿素外)，也可以利用含有机氮源和无机氮源的复合氮源，但不能利用单一的无机氮源，如硫酸铵、亚硝酸钠、硝酸铵等。该菌的培养温度范围宽，在10-40℃均能生长，但在25-37℃生长较好，生产次生代谢产物的最佳温度为28-30℃。同时各种金属离子，如Mg²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、K⁺、Na⁺等对该菌生长没有显著影响。虽然上述碳源、氮源、金属离子以及温度对该菌的生 长没有明显影响，但是其碳氮源浓度、金属离子和培养温度对该菌发酵生产次生代谢产物有显著影响。通过优化，确定最佳培养条件为去皮土豆20％，葡萄糖2％，蛋白胨0.25％，硫酸铵0.25％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，氯化锰0.01％，起始pH6.5，培养温度28-30℃。