[发明专利]一种添加脯氨酸促进丙酮酸过量积累的方法

说明书

技术领域

一种添加脯氨酸促进丙酮酸过量积累的方法，属于定向改变和优化微生物代谢功能、优化发酵过程技术领域。

技术背景

丙酮酸是多种氨基酸、维生素及其它有用物质的重要前体，在化工、制药及农用化学品工业中有着广泛的用途，因价格昂贵，故推广应用受到限制。

丙酮酸是一种十分重要的有机化工中间体，主要应用于医药、农药和日化工业，近年来丙酮酸的开发应用己成为国内外研究的热点。丙酮酸在医药工业中被用于合成治疗高血压新药血管紧张肽II抗药、系列蛋白酶抑制剂、镇静剂、消炎阵痛药辛可芬、抗结核药异烟肼丙酮酸钙、解热药2-苯基喹啉-4-羧酸、驱虫药恩波吡维胺、药物磷酸烯醇丙酮酸、4-甲唑甲酸、抗病毒剂氮杂喹喔啉以及噻咪唑药物等。值得一提的是，丙酮酸在人体柠檬酸循环和合成氨基酸及其糖类中是重要的中间体，可以使脂肪代谢率达到48％，对人体安全性高，因此近年来国外发达国家利用丙酮酸这一特性，以其钙盐作为减肥保健药品。国外有关媒体已经报道，含有丙酮酸钙的减肥药已经风靡全球，成为减肥药市场上的新宠。

在丙酮酸的发酵过程中，为了维持发酵体系pH处于最适范围而流加一定量的NaOH等碱性物质，且随着NaOH等的添加，发酵液的渗透压不断升高，导致细胞凋亡和积累丙酮酸能力的下降，最终影响有机酸生产效率。

本发明通过研究脯氨酸对高渗条件下酵母细胞的保护作用，提出针对性更强的发酵过程优化策略。

发明内容

本发明的目的是提供一种添加脯氨酸促进丙酮酸过量积累的方法，添加脯氨酸作为渗透相容性物质实现丙酮酸过量积累，利用本发明能提高丙酮酸发酵的产量、生产强度和得率。

本发明的技术方案：一种添加脯氨酸促进丙酮酸过量积累的方法，其特征是利用多重维生素营养缺陷型的光滑球拟酵母(T.glabrata)CCTCC M202019为生产菌株，当发酵过程中丙酮酸钠浓度达到0.4mol/L时，向培养基中添加脯氨酸，使培养基中脯氨酸浓度达到1g/L，脯氨酸作为渗透相容性物质保护光滑球拟酵母细胞，促进CCTCC M202019合成丙酮酸。

1、菌株

光滑球拟酵母(T.glabrata)CCTCC M202019为烟酸(NA)、生物素(Bio)、硫胺素(B1)和吡哆醇(Pdx)四种维生素营养缺陷型，且丙酮酸脱羧酶活性组成型降低，为本研究室选育的菌株，该菌种已申请中国专利，专利号为02113142.2。

2、培养基

种子和斜面培养基(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨10，磷酸二氢钾1，七水硫酸镁0.5；琼脂20(斜面培养基)，pH 5.5。

基本发酵培养基(L)：葡萄糖100g，NH₄SO₄ 7g，乙酸钠6g，KCl 5g，KH₂PO₄ 5g，Mg₂SO₄·7H₂O 0.8g，pH 5.5。

3、培养：

斜面培养：30℃、200rpm下培养24h；

摇瓶培养：将种子以10％的接种量转入基本发酵培养基于30℃、200rpm条件下培养24h，按实验要求添加不同浓度的烟酸、生物素、硫胺素和吡哆醇。

发酵培养：最后在7L发酵罐中进行发酵，发酵条件为：pH 5.5，搅拌转速400rpm，通气速率1.0vvm。

细胞干重的测定：取一定量的菌悬液置于10mL容量瓶中，加2mL盐酸溶解菌悬液中的碳酸钙，加入去离子水定容至10mL，摇匀，用UV 7500型可见分光光度计，于660nm处比色测OD值，用细胞干重标准曲线算得细胞干重。

丙酮酸浓度的测定：高效液相色谱(HPLC)

仪器：Agilent1100高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、视差折光检测器和工作站)，

色谱条件：

色谱柱：C18柱，5μm，4.6mm×250mm

流动相：0.1％H₃PO₄

流速：1mL/min

柱温：28℃

进样量：10μL

紫外检测器波长：210nm

样品制备：5mL发酵液在10000rpm下离心10min，取上清液移入试管中以备测丙酮酸时用。测丙酮酸时，取1mL上清液移入50mL容量瓶中，去离子水定容至刻线，经0.45μm滤膜过滤后，滤液供液相色谱分析用。