[发明专利]可结合血管内皮细胞生长因子及胎盘生长因子的重组蛋白及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术-重组基因工程领域。本发明报道了三种可结合血管内皮细胞生长 因子(VEGF)及胎盘生长因子(PLGF)的重组蛋白制备方法及其应用。

背景技术

血管增生或新生(angiogenesis)是指体内的已存在的血管(如毛细血管和小静脉)通 过出芽或分裂的方式而产生新的血管的过程。血管新生在维持机体的许多正常的生理过程 如组织胚胎发育、外伤伤口的癒合与修复等是有益的和必需的。但过度的血管新生或增生 也与许多病理变化(如肿瘤的增生扩散，炎症反应等)息息相关。体内的血管能够不断地 增生与增长的关键是其内衬的血管内皮细胞具有不断分裂增生及定向迁移置入已有的血管 管壁的能力。血管内皮细胞的增生受体内正(即刺激血管增生)、负(即抑制血管增生) 两大方面因子的调控。其中正面调控血管内皮细胞增生的最为重要的因子是血管内皮细胞 生长因子(vascular endothelial growth factor-A，以下简称VEGF-A或VEGF)及胎盘 生长因子(placental growth factor，以下简称PLGF)。

VEGF及PLGF通过与其表达在血管内皮细胞上的特异受体的结合而介导出刺激血管内 皮细胞分裂及增生的活性(Leung DW等Science 1989，246：1306；Keck PJ等Science， 1989，246：1309)。目前已知的血管内皮细胞生长因子的受体主要有三种：即VEGFR1 (fms-like tyrosine kinase，简称FLT-1)(Shibuya M等Oncogene，1990，5：519；De Vries等Science 1992，255：989)；VEGFR2(Kinase-insert Domain Receptor，简称 KDR；在小鼠中称为Flk-1)(Terman BI等Biochem Biophys Res Commun 1992，187： 1579-1586)和VEGFR3(简称FLT-4)。VEGF/PLGF的受体在结构上很相似，均为I型跨细 胞膜糖蛋白，由一含7个免疫球蛋白样结构的胞外区，一个膜穿透区及一含2个酪氨酸激 酶的膜内区组成。其中的胞外免疫球蛋白样结构区是维持VEGF受体与其配体VEGF高度结 合的关键部位(Davis-Smyth T等EMBO J，1996，15：4919；Fuh G等J Biol Chem，1998， 273，11197)。除了表达在细胞膜上的受体之外，体内还存在有另一种以可溶性蛋白形式 流离于细胞外间质的VEGF受体(Kendall RL and Thomas KA 1993(Kendall RL and Thomas KA Proc Natl Acad Sci USA，1993，90：1070)。该类可溶性VEGF受体为截短的VEGF 受体：即只含胞外免疫球蛋白样结构区，而不含穿膜区及膜内酪氨酸激酶区。与完整的膜 上VEGF受体一样，截短的可溶性VEGF受体保留有与VEGF/PLGF高度结合的生物活性。但 与完整的膜上VEGF受体不同的是：截短的可溶性VEGF受体由于其不含酪氨酸蛋白激酶区， 故在与VEGF/PLGF结合后，一般不会介导出刺激血管内皮细胞分裂及血管新生的活性。相 反的，截短的可溶性VEGF受体更会通过与表达在细胞膜上的完整的VEGF受体竞争结合 VEGF/PLGF，进而抑制VEGF/PLGF及其受体介导的促血管增生。

但体内流离的VEGF/PLGF受体表达水平一般很低，故难以提取与分离到足够量的天然 的VEGF/PLGF受体蛋白以作为药物及研究之用。而以基因工程及细胞培养或细菌发酵技术 在体外大量表达生产重组的VEGF/PLGF受体蛋白则是解决该问题的理想方案。但鉴于 VEGF/PLGF受体富含二硫键(S_S)结构，而二硫键对维持其三级结构及生物学活性起重要 作用，故药物之用的重组VEGF/PLGF受体的表达以采用真核细胞中分泌性表达系统最为理 想。常用的真核表达宿主细胞包括：哺乳动物细胞、昆虫细胞及酵母细胞等，而其中的酵母 细胞(菌)如Pichia.pastoris(毕赤巴斯德酵母)由于兼有原核细胞的生长快速、培养方 便经济、生产成本低廉，及真核细胞的对表达产物的加工修饰的双重优点，近年来已发成为 工业化大规模表达生产重组基因蛋白的最理想宿主。