[发明专利]可结合血管内皮细胞生长因子及胎盘生长因子的重组蛋白及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种可结合血管内皮细胞生长因子VEGF及胎盘生长因子PLGF的重组蛋白，其特征在于 该重组蛋白的N-端中含有VEGF受体的胞膜外免疫球蛋白样结构区，而其C-端的最后2至 20个氨基酸序列中含有至少一对由pro脯氨酸及cys半胱氨酸相邻排列的双氨基酸；

该重组蛋白为由相同的俩个单体蛋白通过其C-端的cys形成的二巯键而形成双聚体， 其中每一单体蛋白的N-端含有VEGF受体Flt-1的胞膜外结构区中的第2及第3免疫球蛋 白样区，该重组蛋白称为重组蛋白F2F3-PC；

或者该重组蛋白为由相同的俩个单体蛋白通过其C-端的cys形成的二巯键而形成双聚 体，其中每一单体蛋白的N-端含有VEGF受体Flt-1的胞膜外结构区中的第2免疫球蛋白样 区及VEGF受体KDR的胞膜外结构区中的第3免疫球蛋白样区，该重组蛋白称为重组蛋白 F2K3-PC；

或者该重组蛋白为由重组蛋白F2F3-PC单体与重组蛋白F2K3-PC单体聚合而成的异源 二聚体；

编码人Flt1受体的胞外免疫球蛋白区D2及D3的基因片段采用RT-PCR方法从健康 人脐静脉内皮细胞中克隆获得；

PCR扩增人Flt1-D2D3基因片段的引物为：

正向上游引物引物flt1-FD2-F-ER，28mer：ggcggaattc att agt gat aca ggt aga及

反向下游引物引物flt1-RD3a332，33mer：gatcgcggccgc gca tgg ttt atc ata tat atg；

PCR扩增人Flt1-D2基因片段的引物为：

正向上游引物flt1-FD2-F-ER，28mer：ggcggaattc att agt gat aca ggt aga及

反向下游引物flt1-RD2a230：gcgggatcc tat gat tgt att ggt ttg tcg；

PCR扩增人KDR-D3基因片段的引物为：

正向上游引物KDR-FD3a221，28mer：gccgggatcc tat agg att tat gat gtg及

反向下游引物KDR-RD3a328，33mer：gatcgcggccgc gca tgg agg ttt ttc atg gac。

2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于该蛋白的C-末端的最后2至20个氨基酸 中所含有的相邻俩个pro及cys氨基酸的排列序列从N-端到C-端为pro-cys或cys-pro。

3.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于该蛋白为含二巯基的同源二聚体。

4.一种制备权利要求1所述的重组蛋白的方法，其特征在于其包括下列步骤：

1)以多聚酶链式反应RT-PCR从健康人细胞组织中克隆获得含编码人VEGF受体的胞膜 外免疫球蛋白样结构区的cDNA；

2)克隆扩增获得的cDNA经限制性内切酶处理后，再用T4连接酶将其与经相应的限制 性内切酶处理的表达载体相连，获得重组表达载体；

3)将上述重组表达载体转入真核宿主细胞，经筛选、扩增培养后获得高效稳定分泌表 达重组人VEGF受体的胞膜外免疫球蛋白样结构区的宿主细胞；

4)收集细胞培养上清液，经离心及以滤膜过滤后，将滤液直接上样至含有偶联有 VEGF/PLGF蛋白或抗-VEGF受体的抗体的亲合层析柱中；

5)亲合层析柱先经PBS洗脱后，再以低pH液洗脱回收被吸附的蛋白；

6)洗脱回收的蛋白再经调节pH至中性及透析与理化鉴定后，即获得纯化的重组人 VEGF受体蛋白。

5.一种根据权利要求4所述的制备重组蛋白的方法，其特征在于所述的用于表达重组 VEGF受体蛋白的宿主细胞为真核细胞。