[发明专利]一种制备可重复利用的磁性纳米固定化酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种磁性纳米固定化酶的制备方法，尤其涉及一种以四氧化三铁纳米颗粒为载体可重复利用的磁性纳米固定化酶的制备方法。

背景技术

酶作为一种高效专一的生物催化剂，被广泛应用于酿造、食品、医药等领域。但由于酶的蛋白质属性，在热、强酸、强碱及有机溶剂中不稳定，故酶通常存在于水溶液中使用，致使其回收和重复利用成为一个难题。

利用四氧化三铁纳米颗粒作为载体制备固定化酶可以有效地解决酶制品回收利用的难题，但现有的固定化方法，多通过在四氧化三铁表面引入硅烷基、羧基等进行表面修饰，进而加入戊二醛、碳二亚胺等交联剂与酶分子交联，但由于所述表面修饰过程中引入了多种化学试剂，导致酶活力严重丧失。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可重复利用的磁性纳米固定化酶的制备方法。该方法可以方便地回收化学性质稳定的固定化酶，特别适用于催化领域、环境污染物降解及能源物质的合成过程。

本发明所述制备可重复利用的磁性纳米固定化酶的方法，步骤如下：

(1)用共沉淀法制备纳米四氧化三铁粉末，所述共沉淀法是以氨水作为沉淀剂，氮气保护下加入氯化高铁与氯化亚铁，其中Fe³⁺∶Fe²⁺∶OH^-的摩尔比为2∶1∶8，化学反应的方程式是：反应后经冷冻干燥得表面吸附氨基的纳米四氧化三铁粉末；

(2)将表面吸附氨基的纳米四氧化三铁粉末分散于蒸馏水中，超声分散得到浓度为0.15～0.5克四氧化三铁/毫升的磁流体；

(3)取步骤(2)所述的磁流体，滴加其体积量0.2～2倍的质量浓度为25％(w/w)的交联剂戊二醛，再加入其体积量0.05～2倍的质量浓度为0.01％～10％(w/w)的酶溶液；

(4)充分混匀后在25℃～30℃温度条件下，交联0.5～1.5小时；

(5)在磁场强度为-150000z～150000z的外磁场作用下固液分离步骤(4)所述的交联产物，然后用蒸馏水洗涤固相产物3～4次，得可重复利用的磁性纳米固定化酶。

将上述制备的固定化酶常规方式冷冻干燥，能进一步获得可重复利用、易储运的固定化酶干粉。

上述制备可重复利用的磁性纳米固定化酶的方法中，步骤(2)所述磁流体的浓度优选0.2～0.4克四氧化三铁/毫升。步骤(3)所述交联剂的滴加量优选是磁流体体积量的0.5～1.5倍；所述酶溶液的加入量优选是磁流体体积量的0.1～1.5倍。步骤(4)所述交联温度优选是30℃，交联时间优选是1小时。

上述制备可重复利用的磁性纳米固定化酶的方法中，步骤(3)所述酶溶液优选是脂肪酶、木瓜蛋白酶、辣根过氧化物酶或葡萄糖苷酶的溶液，其质量浓度优选0.1％～1.5％。

其中：所述酶溶液最优选是脂肪酶溶液。

本发明方法在纳米四氧化三铁的制备过程中加入了氨水作为沉淀剂，将四氧化三铁颗粒表面引入氨基，再加入戊二醛作为交联剂，在交联剂的作用下与酶分子氨基作用，从而交联形成高蛋白质载量的固定化酶。整个过程中酶活力丧失少，操作简便易行，所得固定化酶化学性质稳定，便于回收。冻干后重复利用性不变，且便于储运。

根据所选酶的类型确定底物，测定固定化酶活力。第一轮反应结束后在外磁场作用下固液分离，上清用于测定酶活力，残留固定化酶加入蒸馏水洗涤3次，重新加入等量底物进行下一轮反应。如此重复十次，前三次重复利用后酶活力可保留同等量游离酶活力的60％～95％；重复利用十次后，可保留同等游离酶活力的10％～20％。相对于化学法进行表面修饰制备固定化酶的方法，酶活力提高了6～10倍。固定化酶冻干粉具有相同特性。

本发明与现有技术相比，有如下优点：

本发明方法更加简便易行，其制备的固定化酶具有高蛋白质载量，便于回收的特点，且在制备过程中涉及化学试剂少可保持高酶活力，成品酶在外加磁场的作用下，可经外部磁场回收多次重复利用并保持高的活性回收率，从而提高了酶的利用率，降低了成本。

具体实施方式

实施例1

将1.5克纳米四氧化三铁粉末分散于10毫升蒸馏水中，取1.5毫升加入50微升25％戊二醛，再加入1毫升1％脂肪酶(猪胰腺来源)溶液，室温(约25℃)交联0.5小时。在外磁场作用下固液分离，交联产物用蒸馏水洗涤三次后，得到所需的磁性纳米固定化酶。进一步将制备的固定化酶冷冻干燥，能获得可重复利用、易储运的固定化酶干粉。