[发明专利]对虾白斑综合症病毒快速检测试剂盒的制备和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术进行菌样检测的方法，具体是一种对虾白斑综合症病毒快速检测试剂盒的制备和检测方法。

背景技术

对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus)是新设立的Nimaviridae科Whispovirus属的代表种。对虾白斑综合症病毒WSSV最早出现在上世纪90年代初，是一种具有高度感染性和致死性的病毒，严重危害着全球对虾养殖业并造成了巨大的经济损失，仅我国自1993年爆发以来已累计损失数百亿元，成为海水养殖业危害最大的病毒。WSSV的肆虐立刻引起了许多国家和地区(中国、美国、日本、台湾地区、荷兰、印度、韩国、新加坡等)的高度重视，但由于缺乏对病毒遗传信息和功能特性的了解，影响了病毒的防治研究。

以往检测对虾白斑综合症病毒的主要方法有两种：1.症状观察法，观察发病的对虾行动迟钝，弹跳无力，静卧不动或游动异常(围着池边在水面兜圈或在水中翻滚，)这种异常行为可在几小时内重复出现，直到最后无力活动，腹面朝上慢慢沉到水底，或被其他对虾吃掉。而患病的斑节对虾在濒临死亡时则显示出明显变蓝的现象，并多伴有腹部肌肉混浊。一些幸存的对虾可缓慢恢复正常。个别虾可在甲壳、鳃部的表皮下出现大量黑色素斑点。2.病理确认法。该病毒侵害的主要组织和器官是皮下组织、表皮角质层组织，触角腺、造血组织。病毒寄生在对虾大部分的器官，从而导致全身系统性的坏死；进行血相检查，发现血淋巴细胞减少，血淋巴混浊，淋巴样器官和肝胰脏肿大。血淋巴液凝固时间超过3分钟。濒死虾壳变软，血淋巴液发黄，不易凝固。病毒粒子可在细胞质中继续装配。最后细胞解体，病毒粒子再感染周围细胞。在腹部肌肉纤维之间有时也发现病毒粒子，有的病虾在鳃和触角腺中可看到血细胞变性坏死，包围成结状构造，其大小约为20-50μm；淋巴样器官有血细胞浸润。在显微镜下可见，病虾甲壳内面有直径数毫米的白点，呈重瓣的花朵状，外围较透明，花纹较清楚，中部木透明，花纹着木清。白点在头胸甲上特别清楚，肉眼可见。白点在酸中容易溶解。3.聚合酶链式反应法(PCR法)，该方法较前两种方法快速、灵敏，但需要昂贵的PCR仪并电泳观察结果，或者使用荧光PCR仪检测，检测时间长和成本高。

2004年TomoyaKono报导了使用LAMP技术检测WSSV的技术(TomoyaKono，Ram Savan，Masahiro Sakai，Toshiaki Ttami.Dtection of white spotsyndrome virus in shrimp by loop-medicated isothermal amplification.Journalof Virological Methods.2004，115，59-65.)，但是检测WSSV病毒的亚型比较少，并且没有进一步防止污染的措施。

发明内容

本发明的目的是提供一种对虾白斑综合症病毒的快速检测试剂盒的制备和检测方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

试剂盒：1-2mL环介导等温扩增反应液A、0.5-1.5U/L UNG酶、6-10U/μL Bst DNA聚合酶B和1-3μL显色剂C；显色剂C体积浓度为5％-20％；

其中，每升环介导等温扩增反应液A含1-2mL 10×Thermopol反应缓300-500μmol dNTP、2-4mmol硫酸镁、0.8-1.2μmol上游内引物、0.8-1.2μmol下游内引物、0.2-0.3μmol上游外引物、0.2-0.3μmol下游外引物和1-1.5mol甜菜碱；

上游内引物5-ACCACCTTTGGCGCACCAATCGTGCACGTACATGTCGA-3、

下游内引物5-ACCACACACAAAGGTGCCAACTCTTTGTCGGTAGCTCCAACA-3、

上游外引物5-GGTCTCAGTGCCAGAGTAGG-3、

下游外引物5-TGGTGCCAAAGATTAACCCA-3。

所述dNTP  内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝1∶1∶1∶1到2∶1∶1∶1。所述每升10×Thermopol反应缓冲液含100-300mmol pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、80-120mmol氯化钾、80-120mmol硫酸铵、10-30mmol硫酸镁和0.8-1.5％曲拉通X-100；所述显色剂为荧光染料SYBR GREEN I或DNAGreen。

检测方法：