[发明专利]南瓜蛋白2及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学领域，特别是涉及到生物化学中一种新的核糖体失活 蛋白---南瓜蛋白2的分离纯化，晶体生长技术及其应用。

背景技术

从高等植物中提取的核糖体失活蛋白(Ribosome-Inactivating Protein， 简称：RIP)，RIP是一类能使真核生物细胞的核糖体失活，从而抑制细胞内蛋 白质合成的细胞毒素，其作用机制是具有RNA N-糖苷酶或叫多核苷酸·腺苷糖 苷酶[EC3.2.2.22]活性。根据蛋白分子及其基因的结构，RIP可以分为3类，类 型1 RIP是具RNA N-糖苷酶活性的单肽链蛋白，例如，来自葫芦科植物栝楼块 根的天花粉蛋白(Trichosanthin，简称：TCS)，苦瓜种子的α，β-苦瓜子蛋 白(α，β-Momorcharin，简称：α，β-MOM)和丝瓜种子的丝瓜蛋白a，b(Luffin a，b)。类型2 RIP是双肽链蛋白，例如，来自大戟科植物蓖麻种子的蓖麻毒 素(Ricin)和豆科植物相思树种子的相思子毒素(Abrin)，它是由一条具有RNA N-糖苷酶活性的A链和一条具凝集素活性的B链通过二硫键连接而成的。类型3 RIP是一类茉莉酮诱导的蛋白(jasmonate-induced protein)，它是由具有RNA N-糖苷酶功能的N端结构域和一个未知功能的C端结构域组成，例如来自大麦 的JIP60。从葫芦科植物中分离出来的类型1 RIP，例如天花粉蛋白、苦瓜子蛋 白、丝瓜子蛋白、白泻根蛋白等，均具有抗肿瘤，抗病毒活性，特别是抗艾滋病 毒活性。关于类型1 RIP和类型2 RIP已有很多的专利和文献报道。

南瓜(Cucurbita moschata(Duch.)Poiret)，又叫中国南瓜，是葫芦科 植物南瓜属的一个种。CN1263107提供了从南瓜瓜瓤中分离出的类型1 RIP—— 南瓜蛋白，并公开了它的制备方法。SDS-PAGE显示它的分子量为27kDa. CN1603340提供了南瓜蛋白的糖苷酶活性和抗肿瘤活性。中国专利 2007100084026提供了南瓜蛋白245个氨基酸顺序。Barbieri等人(Biochimica et Biophysica Acta 1760(2006)783-792)提供了从南瓜瓜瓤中提取一种 新的RIP：C.moschata RIP，它的分子量为30665Da，并测定了它的N端30个 氨基酸顺序。Xia等人(Cell Research(2003)13：369-374)从南瓜子中提取出 moschatin，它的分子量为29kDa，并测定了它的N端10个氨基酸顺序。关于南 瓜果中的其它核糖体失活蛋白，未见报道。

发明内容

本发明的目的是基于上述现有技术基础，寻找一种新的核糖体失活—南瓜蛋 白2，探讨其制备技术，以及晶体生长技术，为南瓜蛋白2的结构与功能研究及 应用提供物质基础和实验数据。

本发明的技术方案是从南瓜中提取南瓜蛋白的同时分离纯化出新的RIP，通 过包括以下四个步骤快速分离纯化得到南瓜蛋白2：

(1).去掉皮和种子的南瓜瓜瓤加pH4.5，10mM醋酸缓冲液进行匀浆。

(2).匀浆液用50％的冰醋酸调pH3.5-4.5，最佳为pH4.0，然后在4℃ 条件下，16000×g离心30’，收集上清液。

(3).加样到pH4.5，20mM醋酸缓冲液平衡的强阳离子柱上，280nM实时 检测，用pH4.5，20mM醋酸缓冲液洗至基线，再用pH6.5，20mM磷酸盐缓冲 液洗至基线，然后用0-0.6M NaCl在pH6.5，20mM磷酸盐缓冲液进行梯 度洗脱，收集第1峰。一般情况下，洗脱出的第2峰就是先前报道的南瓜蛋白。

(4).合并峰1，用50％的冰醋酸调pH4.0，同时加2倍体积的pH4.5，20mM 醋酸缓冲液，再加样到用pH4.5，20mM醋酸缓冲液平衡的强阳离子柱上，280nM 实时检测，用pH4.5，20mM醋酸缓冲液洗至基线，再用pH7.5，10mM磷酸盐 缓冲液洗至基线，然后用0-1M NaCl在pH7.5，10mM磷酸盐缓冲液中进 行梯度洗脱，收集主要的峰，该峰就是高度纯化的南瓜蛋白2。