[发明专利]通过用抗切割探针形成切割结构而检测靶核酸的方法

权利要求书

1.一种组合物，其包含聚合酶、切割剂、上游引物和下游抗切割探针，其中所述抗切割探针包含抗切割部分和易切割部分，其中所述抗切割部分在形成重叠结构后不易被所述切割剂切割，而所述易切割部分在形成非重叠切割结构后易被所述切割剂切割。

2.权利要求1的组合物，其中所述抗切割部分包含一或多种修饰，所述修饰造成+1位下游的部分不易被切割。

3.权利要求1的组合物，其中所述抗切割探针包含一或多种修饰，所述修饰造成+2位下游的部分不易被切割。

4.权利要求1的组合物，其中所述抗切割探针具有位于肘弯上游并与之相连的一段两个或更多个胸苷。

5.权利要求1的组合物，其中所述抗切割探针具有位于肘弯上游并与之相连的一段三个或更多个胸苷。

6.权利要求2的组合物，其中所述修饰是硫代磷酸酯。

7.权利要求2的组合物，其中所述修饰是2’-O-甲氧基。

8.权利要求1的组合物，其中所述抗切割探针包含不抗切割的靶互补区，且所述靶互补区的T_m低于进行引物延伸的温度。

9.权利要求1的组合物，其中所述抗切割探针包含至少一种能够产生信号的标记部分。

10.权利要求1的组合物，其中所述抗切割探针包含一对产生相互作用信号的标记部分，所述标记部分被有效地放置以猝灭可检测信号的产生，所述标记部分被易被FEN核酸酶切割的位点分开。

11.权利要求10的组合物，其中所述一对产生相互作用信号的部分包含猝灭剂部分和荧光部分。

12.权利要求10的组合物，其中所述一对产生相互作用信号的部分被有效地放置以便它们在非重叠切割结构被切割后分开。

13.权利要求12的组合物，其中所述一对产生相互作用信号的部分的第一成员有效地偶联于位置+1，且所述一对产生相互作用信号的部分的第二成员有效地偶联于5’活瓣。

14.权利要求1的组合物，还包含上游寡核苷酸，所述上游寡核苷酸和所述引物与所述靶的相同区域互补，且所述上游寡核苷酸包含至少一个不与所述靶互补的3’末端核苷酸。

15.权利要求1的组合物，还包含与靶的区域互补的上游寡核苷酸，所述区域位于所述靶的与所述下游抗切割探针互补的区域的上游并与之邻近。

16.权利要求1的组合物，还包含反向引物。

17.权利要求1的组合物，其中所述聚合酶基本上缺乏5’至3’核酸酶活性。

18.权利要求1的组合物，其中所述切割剂包含5’核酸酶。

19.权利要求4的组合物，其中所述5’核酸酶是FEN-1核酸酶。

20.权利要求5的组合物，其中所述FEN-1核酸酶是活瓣特异性核酸酶。

21.权利要求5的组合物，其中所述FEN-1核酸酶具有热稳定性。

22.权利要求1的组合物，其中所述聚合酶具有热稳定性。

23.权利要求1的组合物，其中所述抗切割探针的3’核苷酸具有封闭基团。

24.一种组合物，其包含聚合酶、切割剂、上游寡核苷酸和下游抗切割探针，其中所述抗切割探针包含抗切割部分和易切割部分，所述上游寡核苷酸具有至少一个与靶不互补的3’末端核苷酸，其中所述抗切割部分在形成重叠结构后不易被所述切割剂切割，而所述易切割部分在形成非重叠切割结构后易被所述切割剂切割。

25.权利要求19a的组合物，其中所述上游寡核苷酸与靶的区域互补，所述区域邻近所述靶的与所述下游抗切割探针互补的区域。

26.权利要求19b的组合物，其中上游寡核苷酸和下游抗切割探针的所述靶互补区当与靶核酸杂交时被缺口分开。

27.权利要求19b的组合物，其中上游寡核苷酸和下游抗切割探针的所述靶互补区当与靶核酸杂交时被切口分开。

28.一种试剂盒，其包含权利要求1的组合物及其包装材料。