[发明专利]不使用蛋制备流感病毒疫苗

说明书

将本文引用的所有文献以全文纳入本文作参考。

技术领域

本发明属于保护免受流感病毒感染的疫苗的制造领域。

背景技术

目前对抗人流感病毒感染的季节性疫苗的制备方法包括以下步骤[1，2]： (a)分离流通的病毒株；(b)对分离的病毒进行抗原和遗传分析；(c)选择在将要 来临的季节中适用的病毒株；(d)通过重配或采用反向遗传学制备高生长种株； (e)将种株分发给疫苗生产商；(f)由生产商评价该种株在工业生产中的适用性； 和(g)培养种株以制备病毒，然后由该病毒制造疫苗。

该过程中步骤(a)-(e)由FDA和政府批准的国际流感中心进行，通常得到世 界卫生组织的资助；步骤(f)和(g)由生产商自己进行。

步骤(d)将病毒从天然适合感染人体的形式转化为可以在工业培养条件下 生长至高效价的形式。对于甲型流感病毒，该步骤通常包括产生6：2重配株， 该重配株包括来自(c)中选择的毒株的HA和NA编码基因组区段，其余6个基 因组区段来自在鸡蛋中有效培养的毒株，该毒株通常是A/PR/8/34。重配步骤 后，毒株在含胚蛋中反复传代以实现蛋适应和生长促进。对于乙型流感病毒， 通常可直接获得具有优良生长特征的原型株并在含胚蛋中反复传代而无需产 生重配病毒。

因此，分发给疫苗生产商之前进行的步骤包括在蛋中对流感病毒进行传 代。即使在步骤(g)中由生产商在细胞底物上而不是蛋上培养病毒，病毒仍将在 步骤(a)的分离和步骤(e)的生产商接受之间的某些阶段通过蛋进行传代。

例如，步骤(a)包括使底物与患者样品相接触，使得任何样品上的病毒可感 染底物。然后，底物扩增存在的病毒，得到扩增后的病毒用于进一步研究。该 步骤在蛋或哺乳动物细胞中进行。已知可用于原代分离的细胞包括：MRC-5 细胞[3]、Vero细胞[4、5]、MDCK细胞[6]、HepG2细胞[7]、LLC MK2细胞[8] 等。但是，通常仍然使用鸡蛋来分离用于制造流感病毒的参比株。鸡蛋的使用 在当前操作中至关重要，在2003年第四季度，FDA否决了大多数适当的H3N2 毒株的使用(A/Fujian/411/2002)，因为它们最初不是从鸡蛋分离的[29]，并且也 没有获得抗原性类似的从蛋分离的毒株。

过去曾提出在流感病毒生产的多个阶段不再使用鸡蛋。

参考文献10提出，疫苗应采用(i)经传代的高生长临床分离株或(ii)从至 少一种天然来源的哺乳动物流感病毒株衍生的重配株，在细胞培养物中培养， 前提是所述分离株或重配株没有经过禽蛋传代。因此，参考文献10所述的方 法从经选择或操作利于在所选细胞培养物中培养的种病毒开始。

参考文献11比较了通过蛋传代的病毒和通过MDCK细胞传代的病毒，但 特别选择前者用于疫苗制备。

参考文献12建议，大流行性流感疫苗的种病毒可通过以下方式制备：大 流行毒株在哺乳动物细胞培养物上直接繁殖而不是通过胚胎蛋，但指出蛋传代 是大流行间期制造所必须的。这种强制性蛋传代的原因在于，人们相信蛋传代 可用作外来物质的“滤器”：管理机构已接受，在从人体进行最初临床分离到 给予人体的最终疫苗产品的过程中，在禽类系统中进行一系列传代能防止哺乳 动物类型的外来物质与流感病毒共同复制。

本发明的目的是提供适用于流感疫苗生产的额外方法，该方法减少了蛋的 使用，较佳地避免使用蛋。在一个具体的方面，本发明的目的是提供在流感病 毒分离过程中有用的额外和改善的操作。

发明内容

虽然过去曾提出在流感病毒生产的多个阶段不再使用鸡蛋，本发明在多个 方面与这些建议不同。

种病毒的制备

本发明的第一方面提供了制备用于制造疫苗的流感种病毒的方法，该方法 包括以下步骤：(i)用从患者直接获得的或来自原代分离物的流感病毒感染细胞 系；(ii)将步骤(i)中所得受感染细胞系的病毒进行至少一次传代；和(iii)对步骤 (ii)的受感染细胞进行培养以制备流感病毒。从步骤(iii)培养物纯化的流感病 毒即可用作种病毒。

与参考文献12不同，步骤(i)中使用的流感病毒是乙型流感病毒或是非大 流行性甲型流感病毒，即目前是甲型流感病毒H1N1或H3N2株。