[发明专利]同型乳酸的嗜热芽孢杆菌的遗传修饰

权利要求书

1.用于通过遗传改造来修饰兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢 杆菌属物种的方法，所述方法包括：

将克隆在包含pSH71复制子或其同系物的热敏感型质粒系统中的 DNA引入兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种的细胞中， 其中所述同系物包含编码具有热敏感型复制功能的多肽即RepA蛋白 的DNA序列，所述多肽具有与SEQ ID NO：1至少98％相同的氨基酸序 列；

于对于质粒复制而言的许可温度下在选择培养基上培养所述细 胞，以选择能够于所述许可温度下在所述选择培养基上生长的经转化 的细胞；

于对于质粒复制而言的非许可温度下在选择培养基上培养所述经 转化的细胞，以选择能够于所述非许可温度下在所述选择培养基上生 长的经转化的细胞；

其中所述芽孢杆菌属物种是凝结芽孢杆菌。

2.根据权利要求1的方法，其中所述芽孢杆菌属物种是在孢子形 成方面具有缺陷的。

3.根据权利要求1的方法，其中所述DNA提供所需的功能性。

4.根据权利要求1的方法，其中于对于质粒复制而言的非许可温 度下进行的培养允许将所述DNA引入芽孢杆菌染色体中。

5.根据权利要求4的方法，其中所述DNA通过同源重组引入芽孢 杆菌染色体中。

6.根据权利要求1的方法，其中所述多肽具有与SEQ ID NO：1 至少99％相同的氨基酸序列。

7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中通过同源重组从芽 孢杆菌染色体中去除不需要的功能性。

8.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中通过同源重组向芽 孢杆菌染色体中引入所需的功能性并同时从芽孢杆菌染色体中去除不 需要的功能性。

9.根据权利要求8的方法，其中通过将编码S-乳酸脱氢酶的基 因替换为DNA构建体来修饰芽孢杆菌属物种，所述DNA构建体包含编 码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的DNA序列，所述DNA序列与在芽孢杆 菌属物种中有功能的启动子相融合。

10.根据权利要求9的方法，其中所述启动子来自被去除的内源 S-乳酸脱氢酶基因。

11.通过权利要求9或10的方法可获得的经遗传修饰的中度嗜热 芽孢杆菌菌株，其是兼性厌氧且同型乳酸的，并且所述芽孢杆菌菌株 是凝结芽孢杆菌菌株，其中编码S-乳酸脱氢酶的l dhL基因被编码具 有R-乳酸脱氢酶活性的NADH依赖性2-羟酸脱氢酶的基因所取代。

12.用于制备R-乳酸和/或R-乳酸盐的方法，其中使用权利要求 11的经遗传修饰的兼性厌氧的中度嗜热芽孢杆菌菌株。