[发明专利]一种含有糖链的白蛋白、其制备方法及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种在特定的氨基酸残基上选择性添加了糖链的新型含糖链的白蛋白蛋白质，其制备方法及其用途。更具体地，本发明涉及包含可通过宿主细胞进行糖链修饰的部分氨基酸的变异型白蛋白的该部分氨基酸上选择性地附加了糖链的、含糖链的白蛋白。编码该变异型白蛋白的DNA，通过培养含有该DNA的真核细胞制备该含糖链的白蛋白蛋白质的方法，及该蛋白质作为药物载体的用途。

背景技术

人血清白蛋白(以下称为“HSA”)广泛分布于体内血液及细胞间液中。其一级结构是由585个氨基酸组成的，不具有糖链结构，且分子量大约为66.5kDa的单纯蛋白质。该蛋白质在肝脏中的作用主要是负责维持血流中的正常渗透压、及维持血液中的液体含量。因此，在多种临床状况下，例如外科手术、休克、烧伤、浮肿引起的低蛋白血症等，存在血管液体损失的状态中，常用HSA进行治疗。

此外，HSA起到了作为多种血清分子载体的机能，由于安全性、生物适应性、生物分解性、血中滞留性强，因此在动态特性方面存在问题的药物给药系统(DDS)中可以作为优选载体。

目前存在通过HSA与药物不可逆结合的DDS，利用HSA的较长半衰期来提高结合的药物在血中滞留性的方法、以及使用HSA修饰体作为主动输送系统的载体的方法等。在前者中，已经尝试通过基因融合技术使半衰期较短的蛋白质及生理活性肽等作为杂合体表达。另一方面，在后者中，尝试深入研究了阴离子化、阳离子化等调节HSA的物理化学性质的方法，以及通过导入糖结构、肽等存在于细胞表面的受体的识别元件(装置)，实现精密的动态控制及细胞特异性靶定(非专利文献1至6)。

在肝脏中已知存在识别糖残基及负电荷等的受体。利用这种性质，与琥珀酸及半乳糖、甘露糖等结合的白蛋白可用于对肝脏靶向。

然而，在对HSA进行化学修饰时，了解到其具有

(1)除非结合了非常多的糖残基，否则无法识别肝脏；

半乳糖修饰的白蛋白除非在每个白蛋白分子上结合10个以上的半乳糖，否则无法识别肝脏(参见非专利文献5)。

(2)对肝脏非实质细胞群的细胞特异性较低：

甘露糖及岩藻糖修饰的白蛋白已知可被肝内皮细胞及肝巨噬细胞两种细胞吸收(参见非专利文献6)。

(3)很难制备均一的结合体，必须找到适当的结合条件；

等等的问题。因此，强烈希望开发出一种使用非化学手段修饰HSA的方法。

非专利文献1：Lee YC等人，Biochemisty 15：3956-3963，1976

非专利文献2：Opanasopit P等人，Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.280：879-889，2001

非专利文献3：Takakura Y等人，Int.J.Pharm.105：19-29，1994

非专利文献4：Yamasaki Y等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.301：467-477，2002

非专利文献5：Nishikawa M等人，Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.268：G849-G856，1995

非专利文献6：Higuchi Y等人，Int.J.Pharm.287：147-154，2004

本发明的目的是提供一种可在肝脏、尤其是肝巨噬细胞中特异性移动的、均一的含糖链的白蛋白，更具体是提供血清白蛋白，还提供一种适用于递送至肝脏的DDS的药物载体。

本发明人为了达成上述目的，进行锐意研究，得到以下结果：利用定点诱变法，将N结合型糖链的共有序列(Asn-X-Thr/Ser)导入编码HSA的DNA中，通过培养经含有编码所获得的变异型HSA的DNA的表达载体转化的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，成功制备了肝脏转移性较高的、在该共有序列的Asn残基上添加添加了高甘露糖型糖链的含糖链的HSA，由此完成了本发明。

发明内容

即，本发明提供了：

(1)包含可通过宿主细胞进行糖链修饰的部分氨基酸的变异型白蛋白的该部分氨基酸上选择性地附加了糖链的、含糖链的白蛋白；

(2)上述(1)所述的蛋白质，其中糖链是高甘露糖型糖链；

(3)上述(1)或(2)所述的蛋白质，其中该部分氨基酸序列至少一个是Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Ser(Xaa是涉及遗传编码的任意氨基酸)；