[发明专利]一种生产3-羟基丙酸的方法

权利要求书

1.一种生产3-羟基丙酸的方法，是以1,3-丙二醇为原料，用表达1,3-丙二醇 脱氢酶和醛基氧化酶的微生物生产3-羟基丙酸；

所述微生物为恶臭假单孢菌（Pseudomonas putida）、嗜水气单孢菌（Aeromonas  hydrophila）、大肠杆菌（Escherichia coli）或谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium  glutamicum）；

所述恶臭假单孢菌（Pseudomonas putida）为恶臭假单孢菌（Pseudomonas  putida）KT2440或恶臭假单孢菌（Pseudomonas putida）KT2442；

所述嗜水气单孢菌（Aeromonas hydrophila）为嗜水气单孢菌（Aeromonas  hydrophila）ATCC7966或嗜水气单孢菌（Aeromonas hydrophila）4AK4-1；

所述大肠杆菌（Escherichia coli）为大肠杆菌（Escherichia coli）K12MG1655＇ 或大肠杆菌（Escherichia coli）S17-1＇；

所述谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）为谷氨酸棒杆菌 （Corynebacterium glutamicum）ATCC13032-1；

所述大肠杆菌（Escherichia coli）S17-1＇的制备方法如下：

将序列表中序列1所示1,3-丙二醇脱氢酶基因用XhoI和ClaI酶切，得到酶切 产物A；将pBBR1MCS2载体用XhoI和ClaI酶切，回收其中5.1kb的DNA片段 得到酶切产物B；将酶切产物A和酶切产物B连接，得到重组载体pZL-dhaT；

将序列如序列表中序列2所示醛基氧化酶基因用ClaI和BamHI酶切，得到酶 切产物E；将重组载体pZL-dhaT用ClaI和BamHI酶切，回收其中6.3kb的DNA 片段，得到酶切产物F；将酶切产物E和酶切产物F连接，得到重组载体 pZL-dhaT-aldD；pZL-dhaT-aldD的质粒图谱如图2所示；

将质粒pZL-dhaT-aldD电转化到E.coli S17-1中，将得到的菌株命名为大肠杆 菌（Escherichia coli）S17-1＇；

所述大肠杆菌（Escherichia coli）K12MG1655＇的制备方法如下：

将所述重组载体pZL-dhaT-aldD电转化到E.coli K12MG1655中，将得到的菌 株命名为大肠杆菌（Escherichia coli）K12MG1655＇；

所述嗜水气单孢菌（Aeromonas hydrophila）4AK4-1的制备方法如下：

将大肠杆菌（Escherichia coli）S17-1＇接种于LB培养基上，37℃培养13小 时，同时将Aeromonas hydrophila 4AK4在30℃培养20小时，将上述两种菌液等体 积混合，30℃温浴培养20分钟后涂布在含有100ug/ml氨苄青霉素和50ug/ml卡那 霉素的LB平板上培养16小时以进行接合转化，挑取单克隆进行鉴定，得到转入 pZL-dhaT-aldD的重组嗜水气单孢菌4AK4-1；

所述谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032-1的制备方法如下：

利用引物mobR-U和mobR-D从pK18MobSacB载体中克隆Mob序列，用NdeI 和EcoRV酶切，得到酶切产物H；将pEC-XK99E载体用NdeI和EcoRV酶切，回 收其中5.8kb的DNA片段得到酶切产物I；将酶切产物H和酶切产物I连接，得到 6.4kb的连接了Mob序列的质粒，命名为K；

以序列表中序列3所示Linker为模板，用引物mcs-U、mcs-D进行PCR构建含 poly-A尾巴的Linker序列；将PCR产物与pMD18-T Simple载体连接，得到2.8kb 的连接了Linker序列的质粒，命名为M；

将质粒pZL-dhaT-aldD用XhoI和BamHI酶切，回收其中2.7kb的包含dhaT 和aldD基因序列的DNA片段，得到酶切产物N；将质粒M用XhoI和BamHI酶 切，琼脂糖凝胶电泳回收其中2.7kb的DNA片段，得到酶切产物O；将酶切产物 N和酶切产物O连接，得到5.4kb的连接了dhaT和aldD基因以及Linker的DNA 片段的质粒，命名为Q；

将质粒Q用SacI和BamHI酶切，回收其中2.7kb的包含dhaT和aldD基因序 列的DNA片段，得到酶切产物R；将质粒K用SacI和BamHI酶切，回收其中6.4kb 的DNA片段得到酶切产物S；将酶切产物R和酶切产物S连接，得到9.1kb的连 接了dhaT和aldD基因序列、Linker序列和Mob序列的DNA片段的质粒，命名为 pEC-XK99EMOB-DhaT-AldD；pEC-XK99EMOB-DhaT-AldD的质粒图谱如图3所 示；

将质粒pEC-XK99EMOB-DhaT-AldD转化到E.coli S 17-1中，将得到的菌株命 名为E.coli S 17-1″；

将E.coli S17-1″接种于LB培养基上，37℃培养13小时，同时将 Corynebacterium gutamicum ATCC13032在30℃培养20小时，将上述两种菌液等 体积混合，30℃温浴培养12小时后涂布在含有50ug/ml萘啶酮酸和50ug/ml卡那霉 素的LB平板上，再培养16小时以进行接合转化，挑取单克隆进行鉴定，得到转 入pEC-XK99EMOB-DhaT-AldD的重组谷氨酸棒杆菌ATCC13032-1；

mobR-U的序列为TTAACATATGAGTCCACGACGCCCGTGATTTTGTA；

mobR-D的序列为TTAAGATATCCTTTGGCATCGTCTCTCGCCTGTCC；

mcs-U的序列为GAGCTCACTCGAGACTTGAGGAAGCCCAGCATGACAT；

mcs-D的序列为GATACTGGATCCGGGTTTACACGGAGTTCTATCG。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述1,3-丙二醇脱氢酶的氨基 酸序列是GenBank Accession Number NP_744947的自氨基末端第1位至394位氨 基酸残基；所述醛基氧化酶的氨基酸序列是GenBank Accession Number NP_742708 的自氨基末端第1位至506位氨基酸残基。