[发明专利]一种鼠李糖脂生物发酵液的工业化制备方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种生物表面活性剂的生产方法，尤其是一种鼠李糖脂生物发酵液的工业化制备方法。

背景技术：

鼠李糖脂属于一种糖脂类表面活性剂，是在发酵过程中微生物生长到一定阶段在适宜的条件下产生的一种胞外代谢产物，它是生物表面活性剂中效果较好的一种，同其它合成的表面活性剂一样，其分子结构具有亲水和疏水两种性能，并能降低表面张力，同时它有自己的特点：具有很高的生物降解性和更低的生物毒性、低的临界胶束浓度和更高的表面活性、吸收逐步、活性持续等特点。目前鼠李糖脂的研究一直都处在室内研究阶段，没有形成工业化生产规模并且发酵液鼠李糖脂含量低。目前，生产鼠李糖脂大多采用微生物发酵法，但仅限于实验室阶段，尚为进入工业化大生产阶段且没有与之相匹配的制备方法，并且现有的制备方法效率低、成本高及含量低，因此应用受到限制。

发明内容：

为了克服背景技术的不足，本发明提供一种新型的鼠李糖脂生物发酵液的工业化生产方法，这种生产工艺具有产量高、效率高、装料系数高、发酵周期短、工艺简单，使产品综合成本降低，完全适合工业化生产，对鼠李糖脂生物表面活性剂的推广及大规模应用起到了重要的作用。

本发明的技术方案是：该鼠李糖脂发酵液是由在石油污染的土壤中提取并经过分离纯化得到的铜绿假单胞菌经亚硝基胍诱变发酵培养产生，该生物材料分类命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)保藏编号为：CGMCC2200，保藏日期为2007年10月17日、保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、地址北为京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，具体发酵培养步骤如下：A、菌种VTS-1接入摇瓶培养，温度为32±2℃、120转/分震荡培养12～16小时，得到摇瓶菌种；B、一级发酵培养：将A步骤中的摇瓶菌种按5％～10％的接种量转接入装有培养基的一级发酵罐中，在温度为32±2℃、pH6.5～7.5、通风比1∶0.5～1及搅拌速度为100～150转/分的条件下发酵培养10～18小时，得到一级发酵菌种；C、二级发酵培养：将B步骤中的一级发酵菌种按5％～10％的接种量转接入装有培养基的二级发酵罐中，在温度为32±2℃、pH6.5～7.5、通风比1∶0.5～1及搅拌速度为100～150转/分的条件下发酵培养10～18小时，得到二级发酵菌种；D、发酵培养：将C步骤中的二级发酵菌种按5％～10％的接种量转接入装有培养基的三级发酵罐中，在温度为32±2℃、pH6.5～7.5、通风比1∶0.5～1、搅拌速度为100～150转/分及补料条件下发酵培养45～55小时，再进行80℃灭菌得到鼠李糖脂发酵液。

上述的斜面培养基配方：牛肉膏0.3％、蛋白胨1％、NaCl 0.5％、琼脂2％，其余为蒸馏水，pH6.2；摇瓶及发酵罐培养基配方：玉米油2～5％、尿素0.2～1.5％、糖蜜15～20％、KCl 0.05～1.0％、KH₂PO₄0.05～1.2％、K₂HPO₄ 0.05～1.5％、酵母膏0.005～0.1％及复合微量元素0.005～0.01％，余量为水，pH为6.5，所述的复合微量元素为Zn 1.5g/L、Cu 1.0g/L、Mn 1.0g/L、Se 1.5g/L、Co 1.0g/L及溶剂水复配而成；步骤D中所补的料是玉米油，每次补料量为1％～5％；各级发酵罐的装料系数是60～75％。

本发明具有如下有益效果：本发明是通过特定的微生物在适宜的培养基、培养环境、工艺控制等条件下和工艺下进行微生物发酵培养得到的一种生物发酵液。整个生产制备过程是逐级扩大发酵纯培养的过程。得到的鼠李糖脂生物表面活性剂发酵液经过杀菌和离心分离后，根据各种用途的需要纯化成不同等级的产品，广泛应用于三次采油、日化、农药、食品、土壤修复等行业。该生产工艺生产的鼠李糖脂生物表面活性剂，具有产量高、周期短、装料系数高、工艺简单等特点，实现了鼠李糖脂生物表面活性剂的工业化生产。本发明具有以下优点：(1)本发明首次将化学诱变方法应用与假单胞菌，并且成功得到了一株鼠李糖脂高产菌株Pseudomonas sp.VTS-1，为将来的基因工程改造假单胞菌奠定了实践基础；(2)本发明的鼠李糖脂含量达到35～45g/L，并取得了工业化生产实验的成功，发酵周期缩短到50小时，大大降低了生产成本；(3)本发明首次将工业化生产的鼠李糖脂发酵液应用现场，将其注入地下油层，使原来难以注水的区块水顺利注入，并且使原油采收率提高了3～7％；效率高。