[发明专利]春石斛组织培养快繁方法

权利要求书

1.春石斛组织培养快繁方法，其特征在于包括以下步骤：

1)选择具有较好品种特征且生长健壮的春石斛幼茎作外植体，幼茎长度为3-5cm；

2)外植体的处理：剥去幼茎外面节上的叶片，洗净后先用70-75％酒精浸润或擦洗带叶和叶鞘的幼茎，再剥去下部叶和叶鞘，留下包裹茎尖的1-2片叶，在0.1-0.15％升汞中浸泡6-8分钟，然后在8-10％的NaClo溶液中浸泡15-20分钟，最后用蒸馏水洗至无异味；

3)切除与消毒剂接触过的外植体切面，在无菌接种室中，采用刀背挤压法挤出茎尖，接种到具有初始培养基的试管中，一个试管接一个茎尖，于无菌培养室中培养10-15天；

4)诱导和增殖培养：将存活的茎尖转接到诱导培养基上诱导不定芽或原球茎，培养30-40天后转接到增殖培养基中进行增殖培养，培养2-3个月；

5)继代生根培养：

a)将步骤4)中生成的不定芽切割成单个的不定芽接入生根培养基中培养，待苗生长至高3-5cm、有5片以上叶片和4-6条根时，进行下步移栽；

b)取步骤4)中诱导成的原球茎转接到增殖培养基中进行增殖培养30-40天，再转接到催芽培养基中催芽，生长30-40天后，将其切割成单个的不定芽接入生根培养基中培养，待苗生长至高3-5cm、有5片以上叶片和4-6条根时，进行下步移栽；

6)移栽：移栽前5-6天放于大棚中练苗，并提前1-2天把瓶盖全部打开或打开一半，从试管中取出的幼苗用水将附着在根上的培养基冲掉，采用纯水苔作为培养基质，单株移栽到128孔穴盘中；

上述采用的培养基分别为初始培养基1/2Ms、诱导培养基1/2Ms+BA1.0+NAA0.5、增殖培养基MS+BA1.5+NAA0.5+CH1g/L+5％香蕉、生根培养基1/2MS+IBA0.3mg/L+10％香蕉、催芽培养基1/2Ms+BA0.2+NAA0.1；所述培养基的pH值为5.4-5.8，并在121-125℃、1.10-1.15Pa的条件下灭菌20-25分钟。

2.如权利要求1所述的春石斛组织培养快繁方法，其特征在于移栽苗二周内采用喷雾保持叶面湿润状态，二周后按干透湿透的原则浇水。

3.如权利要求1所述的春石斛组织培养快繁方法，其特征在于移栽苗第一周进行70％遮光处理，一周以后进行50％遮光处理。

4.如权利要求1所述的春石斛组织培养快繁方法，其特征在于移栽苗20-25天后每周施一次肥，前期肥料选择花宝5号(3000*)或花多多N∶P∶K＝9∶45∶15(3000*)进行叶面喷洒促使长根，后期选择花多多N∶P∶K＝20∶20∶20(3000*)进行叶面喷洒或根部浇灌。

5.如权利要求1所述的春石斛组织培养快繁方法，其特征在于灭菌后的培养基放入准备区备用，准备区每天用紫外灯消毒至少2小时。

6.如权利要求1所述的春石斛组织培养快繁方法，其特征在于在0.1-0.15％升汞中加2-3滴Tween 20。

7.如权利要求1所述的春石斛组织培养快繁方法，其特征在于无菌接种室在接种前30分钟，打开紫外灯和超净工作台，20分钟后关上，再过10分钟进行接种。

8.如权利要求1所述的春石斛组织培养快繁方法，其特征在于无菌培养室使用前一个星期用40％甲醛溶液每平方10ml进行培养室薰蒸，关闭三天后开门通风一天，再用紫外灯消毒6小时。