[发明专利]大肠菌群复合快速显色诊检试剂及其研发工艺流程

说明书

技术领域

本发明涉及食品安全快速诊检试剂，具体涉及一种大肠菌群复合快速显色诊检试剂及其研发工艺流程。

背景技术

由德国科学家科赫所创立的微生物纯培养方法因其费用低廉、灵敏度高，能够对微生物进行定性、定量的特异鉴定，因此时至今日仍为世界微生物学界所普遍接受为甄别微生物的权威方法。但纯培养的缺点也十分明显，从制备培养基、培养微生物、直到形成肉眼可辨的生长特征以及对微生物进行确证其种属特征的生理生化指标的检测，这一系列过程不仅浪费资源，耗时超长，且由于人员对仪器的操作使用以及操作手法的异同都可能造成结果的误判，因此开发一项既能快速准确的鉴别微生物的种属特性、又可以降低成本、同时减少检测迟滞的微生物快速诊检试剂早已经成为国内外微生物检测领域科研人员的迫切愿望，而今各种快速检测试剂盒、纸片、旋转平板法等皿膜法，电阻抗法，生物荧光法，免疫学法，基因探针，分子杂交，基因芯片方法等等层出不穷。但纵观国内外快速诊检技术领域的发展情态，可以看出，无论是传统的以纯培养方法为主的检测技术，还是实时检测技术，国外都已经有了比较成熟的发展模式，以美国的3M、BD公司和法国的科玛嘉、梅里埃公司为代表的一批企业，在快速诊检技术领域的探索方面已经走在了世界的前列。

但是从这类公司购买快速检测试剂价格昂贵，应用成本过高，我国难以承受普及型应用，仅一些科研院所、高校、及有实力的大型企业可以尝试，普通中小型企业、工商业者难以接受，而结合仪器进行实时检测的方法国内落后的步伐更大，购买一台普通的快速检测设备动辄几十万美金。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明的目的是提供一种满足食品药品安全快速显色诊检试剂。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

大肠菌群复合快速显色诊检试剂研发工艺流程：

1、首先通过大肠菌群、质控菌株(沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌)的活化及生化鉴定确定质控手段；

2、根据目的菌株的需要筛选基本营养成分；

3、通过生长谱法验证：微生物的生长繁殖需要适宜的营养环境，碳源、氮源、矿物质、微量元素、生长因子等等都为微生物生长所必需，缺少其中任意一种，微生物就不能正常生长、代谢、繁殖；

5、显示剂、掩蔽剂及增效剂的遴选；

6、复合遴选；

7、通过快速显色培养基各项指标测试验证试验，其包括特异性试验、灵敏度试验、实际样品检验、假阴性、假阳性菌株鉴定、稳定性试验、可重复性试验、竞争菌株及杂菌干扰试验、检出时间、检出率的试验验证复合遴选配方的可行性；

8、通过因素水平正交组合试验遴选出最适配方。

大肠菌群复合快速显色诊检试剂，其快速显色鉴别培养基各项成分的筛选配方为：

快速显色鉴别培养基各项成分：

1、碳源

乳糖；

2、氮源

蛋白胨；

3、矿物质

氯化钠、磷酸氢二钾；

4、掩蔽剂(需遴选)

牛胆盐、煌绿、龙胆紫、孔雀绿、十二烷基磺酸钠；

5、指示剂(需遴选)

氯化三苯四氮唑、伊红、玫红酸、中性红；

6、增效剂

溴甲酚紫、羧甲基纤维素钠

外界条件对菌体生长的影响：

一、PH值：A＝600nm

由上表可以看出大肠菌群的最适PH值范围在6.7～7.5。

当培养时长为12小时时PH值＝6.9时菌种启动生长速度最快；

当培养时长为24小时时PH值＝7.3时大肠菌群菌体浓度最高。原因：

当培养基内PH值过低时大肠菌群乳糖操纵子容易受到信息反馈抑制，菌体能量供应不足，导致迟缓期增加，对数生长期延后并缩短；

当培养基内PH值过高时，菌体内源蛋白合成受到抑制，诱导酶与合成酶的合成受阻。

因此我们选择PH＝6.9做为快速检测试剂的理想PH值。

二、温度为37℃

本发明的目的为快速显色检测大肠菌群，大肠菌群的的最适生长温度为37℃，因此我们选定37℃为检测温度。

培养基主要成分对菌体生长的影响：

我们根据微生物的特异种属特征，分别就快速显色检测试剂的显色剂、掩蔽剂以及增效剂这三个主要方面进行针对性遴选：

1、选择四种显色剂进行配伍，进行灵敏度和准确度试验并以生长谱法做为初筛根据；

2、选择四种掩蔽剂进行配伍，以质控菌株为标准做杂菌干扰试验；