[发明专利]肿瘤抑素抗血管生成小分子多肽、融合蛋白及两者制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种小分子多肽和由它制备的融合蛋白及两者制备方法。

背景技术

肿瘤抑素具有通过抑制新生血管生成，断绝肿瘤组织血液供应和直接抑制肿瘤细胞生长、转移的双重抗肿瘤活性。但现有的肿瘤抑素作为自身抗原能引起肺肾出血综合征，不能用于肿瘤的临床治疗，肿瘤抑素的抗血管生成活性和抗肿瘤细胞生长、转移活性分别位于肿瘤抑素不同区域的小片段上。

发明内容

本发明的目的为了解决肿瘤抑素在治疗肿瘤时会引起肺肾出血综合征的问题，而首次提出肿瘤抑素抗血管生成小分子多肽、融合蛋白及两者制备方法。肿瘤抑素抗血管生成小分子多肽的氨基酸序列为：

MetProPheLeuPheCysAsnValAsnAspValCysAsnPheAlaSerArgAsnAspTyrSer。肿瘤抑素抗血管生成小分子多肽的核苷酸序列为：

TATGCCGTTCTTATTCTGCAATGTTAACGATGTATGCAACTTCGCATCTCGTAATGATTACTCC。肿瘤抑素抗血管生成小分子多肽通过以下方法实现：去掉肿瘤抑素25肽氨基端的苏氨酸，以第二位的蛋氨酸作为氨基端，去除羧基端的酪氨酸、蛋氨酸和亮氨酸三个氨基酸，将25肽改造为21肽，得到肿瘤抑素抗血管生成小分子多肽。肿瘤抑素小分子多肽融合蛋白的氨基酸序列为：

MetProPheLeuPheCysAsnValAsnAspValCysAsnPheAlaSerArgGlyAspTyrSerGlyGlyAlaSerProPheLeuGluCysHisGlyArgGlyThrCysAsnTyrTyrSerAsnSer。肿瘤抑素小分子多肽融合蛋白的核苷酸序列为：

TATGCCGTTCTTATTCTGCAATGTTAACGATGTATGCAACTTCGCATCTCGTGGAGATTACTCCGGAGGAGCTAGCCCTTTCCTAGAATGTCATGGAAGAGGAACGTGCAACTACTACTCAAACTCC。肿瘤抑素小分子多肽融合蛋白的制备方法通过以下步骤制成：1、去掉肿瘤抑素25肽氨基端的苏氨酸，以第二位的蛋氨酸作为氨基端，去除羧基端的酪氨酸、蛋氨酸和亮氨酸三个氨基酸，将25肽改造为21肽；2、将21肽第18位的Asn改为Gly，然后与两边的氨基酸残基组成RGD序列，得到引入RGD序列的21肽；3、将引入RGD序列的21肽和19肽之间加2个Gly进行连接，得到肿瘤抑素小分子多肽融合蛋白。编码上述肿瘤抑素小分子多肽及融合蛋白DNA的反义链3’端缺少与有义链5’端TA配对的两个碱基，反义链与各自的有义链配对形成双链后，有义链5’端多出TA两个碱基，形成粘端，可与Nde I酶切的粘端连接；有义链3’为平端，能与Sma I酶切的平端连接。本发明编码肿瘤抑素小分子多肽融合蛋白的核苷酸序列根据大肠杆菌对密码的偏爱性设计，编码肿瘤抑素小分子多肽融合蛋白的有义链和反义链磷酸化退火后与经Nde I和Sma I双酶切的pTYB2载体重组，再转化大肠杆菌BL21(DE3)。基因工程菌BL21(DE3)经IPTG诱导，用几丁质亲和层析柱便可提取纯化肿瘤抑素小分子多肽融合蛋白。本发明设计的编码肿瘤抑素抗血管生成小分子多肽及融合蛋白的有义链和反义链通过核苷酸自动合成仪合成，经重组转化后可用生物工程方法大规模生产肿瘤抑素抗血管生成小分子多肽及肿瘤抑素小分子多肽融合蛋白。本发明中的肿瘤抑素抗血管生成小分子多肽及肿瘤抑素小分子多肽融合蛋白分子量小，适合静脉、肌肉和皮下注射，易于吸收，用药安全，不会引起肺肾出血综合征，完全可以用于肿瘤的临床治疗，用动物实验对比后发现：19肽抑瘤率为40～42.41％，21肽抑瘤率为40～40.08％，引入RGD的21肽抑瘤率为40～46.88％，本发明中的引入RGD的21肽+1 9肽融合蛋白的抑瘤率达到57.59％以上。

附图说明