[发明专利]拟miRNA序列及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种RNA序列及其制备方法。

背景技术

miRNAs是由具有发夹结构的约70～90个碱基大小的单链RNA前体经过酶加工后生成的一类长约21～25nt的非编码的单链RNA分子，广泛存在于植物和从线虫到人类的细胞中。微小RNA(miRNA)是一种广泛存在、对基因表达进行微调的分子，在人类基因组中miRNA基因约占1％，miRNA的靶向基因多数是参与转录、信号转导、肿瘤发生的基因，是一类进化上保守、在生命中起着重要调控作用的分子。miRNA对靶向基因的微调具有如下优点：①比从蛋白水平的调节更节省能量；②相对于转录调节，miRNA的效果更快而且是可逆的；③对于一些只需微量蛋白进行调节的细胞功能，就可通过miRNA来达到调控目的；④内含子中编码的miRNA是一种可高效利用的细胞内资源。

尽管miRNA的作用也是特异的，特别是5′端的2～8个碱基，特异性靶向于它的靶基因，但是与siRNA(small inference RNA)不同的是miRNA的特异性并不强，在生物体内往往一个miRNA作用于多个靶向基因或多个miRNA调控一个靶向基因，因此缺乏基因特异性。

发明内容

本发明的目的是为了解决miRNA缺乏基因特异性的缺陷，而提供的一种拟miRNA序列及其制备方法。

拟miRNA序列为22nt，序列5’末端有1～8个核苷酸、3’末端有7个核苷酸与目标mRNA的3’UTR的延伸序列特异性互补。上述拟miRNA序列按以下步骤制备：(一)测定目标mRNA的3’UTR的延伸序列；(二)根据延伸序列特异性设计含有22 nt的拟miRNA序列，其中拟miRNA序列5’末端有1～8个核苷酸、3’末端有7个核苷酸与延伸序列特异性互补，即得到拟miRNA序列。

本发明通过MirScan、miRseeker、BLAST及mfold等基因序列分析软件和网上基因序列比对工具测定目标mRNA的3’UTR的延伸序列，并找到目标mRNA的特异性片断，再根据延伸序列特异性设计拟miRNA序列。

本发明中的拟miRNA序列与传统的外源性小分子干扰RNA(siRNA)相比具有以下明显区别：

①虽然拟miRNA和siRNA都是外源性RNA，但siRNA必须与靶标基因序列完全配对才能起到基因沉默的作用，而拟miRNA只需与靶标基因序列配对6个核苷酸便可起到基因沉默的作用。设计拟miRNA比设计siRNA要更容易，因为在靶标基因上寻找一段较短的基因特异性序列显然比寻找一段较长的基因特异性序列的机率要高得多。

②作用位置：拟miRNA与内源性miRNA一致主要作用于靶标基因的3’UTR区，而siRNA可作用于mRNA的任何部位。

③作用方式：拟miRNA与miRNA都主要抑制目标基因的翻译，在某些条件下亦可导致目标基因mRNA降解，即拟miRNA在目标基因转录后抑制起作用；而siRNA通过降解目标基因mRNA而起到基因沉默的作用，不直接影响目标基因的翻译过程。因此一旦消除了拟miRNA之后完整的目标基因mRNA即可恢复翻译过程而合成蛋白，而在消除siRNA之后蛋白翻译过程须待新的消除基因mRNA完成转录后才能重新启动。

人工合成拟miRNA与内源性miRNA具有如下区别：人工合成的拟miRNA是根据目的基因的序列设计而成，基因作用具有特异性，拟miRNA下游调控靶点单一且特异；而内源性miRNA的作用缺乏选择性，一个miRNA可以作用于多个基因，产生多重后续效应。本发明提供的拟miRNA序列因具有基因特异性，为研究miRNAs的功能提供了新的研究手段，可广泛应用于疾病的基因诊断与治疗，并扩展应用于生物学领域。

本发明拟miRNA具有转导稳定、高效表达，安全性高的优点。

附图说明

图1是miR-HCN2基因序列图；图2是miR-HCN4基因序列图；图3是H9c2细胞内转录HCN2的mRNA水平检测图，图中黑色实心条形柱表示转导miR-HCN2后H9c2细胞内mRNA的水平，图中白色空心条形柱表示空白对照组H9c2细胞内mRNA的水平；图4是H9c2细胞内转录HCN4的mRNA水平检测图，图中黑色实心条形柱表示转导miR-HCN4后H9c2细胞内mRNA的水平，图中白色空心条形柱表示空白对照组H9c2细胞内mRNA的水平。

具体实施方式