[发明专利]一种利用适配子快速检测水产品中孔雀石绿的方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品检测领域，尤其涉及一种水产品中孔雀石绿的检测方法。

背景技术

孔雀石绿(Malachite green，简称MG)，属三苯甲烷类染料，其代谢物为无色孔雀石绿(Leucomalachite green，LMG)，长期以来，由于孔雀石绿在水产养殖中具有良好的抗真菌病，水产品保鲜以及价格低廉等优点，因此，成为许多养殖户青睐的“渔药”来使用，但这两种物质所均具有高毒素、高残留和高致畸、致突变等副作用，不仅给我国水产品的出口带来了巨大障碍，而更为重要的是，给人们的健康构成了潜在威胁。

鉴于孔雀石绿及其代谢物的危害性，许多国家都将其列为水产养殖禁用药物，我国也于2002年5月将其列为《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中，然而，由于水产养殖户健康养殖的意识淡薄，以及水产品安全管理机制的不完善等原因，仅2005年，就在国内许多地方(尤其是福建、江西和浙江)的多种水产品(如：鳗鱼、甲鱼等)中检测出孔雀石绿的高残留。

目前，关于孔雀石绿及其代谢物的检测方法主要有三种，但这些方法均存在着一定局限性：(1)高效液相色谱法，当含量较低时，利用保留时间很难定性；(2)气质联用法，只能用来对无色孔雀石绿的进行定性；(3)液质联用法(LC/MS)，效果较好，但价格昂贵；因此，孔雀石绿及其代谢物在水产动物中快速、稳定可靠残留检测方法的建立成为国内外亟待解决的技术难题。

免疫学方法的核心技术就是通过实验动物获得孔雀石绿特异性抗体，但孔雀石绿具有很强的免疫毒性，制备孔雀石绿特异性抗体是一个非常困难的工作，而且制备一种抗体周期也比较长，一般需要6个月以上。因此通过实验动物获得特异性抗体成为了研究孔雀石绿快速检测方法的一个瓶颈问题。

寡核苷酸适配子技术是近年来发展的一种新型的分子印迹技术，是采用SELEX技术体外筛选获得的。SELEX技术由Tuerk和Gold等在90年代初建立的，通过多轮的选择和扩增过程(PCR或RT-PCR)从随机寡核苷酸文库中筛选特异识别靶物质的寡核苷酸适配子的组合化学技术，是一种研究核酸结构与功能的有效方法。SELEX技术自创立以来得到迅猛发展，目前因其具有库容量大、筛选的适配子的靶分子范围广、亲和力高与特异性强等优点已在生命科学基础研究、疾病治疗、药物筛选和临床诊断等领域得到了广泛的探索和运用。

中国发明专利申请200510060995.1中公开了一种水产品中无色孔雀石绿间接竞争ELISA检测试剂盒。试剂盒的检测板为包被无色孔雀石绿与白蛋白偶联物的可拆96孔酶标板，抗无色孔雀石绿抗体为利用无色孔雀石绿与白蛋白的偶联物免疫小鼠而制备的单克隆抗体，检测样品先经过匀质后用乙酸乙酯和环己烷进行提取，调节pH值后稀释用于检测。样本检测的判定标准为：以标样浓度的对数值为横坐标，抑制率为纵坐标的回归曲线。根据每个样品的抑制率就可从曲线上读出相对应样品的浓度。该方法检测的灵敏度为0.0023μg/ml，检测范围是0.0016-1μg/ml。

但该技术中高效的单克隆抗体的获得十分困难，也增加了成本。

发明内容

本发明提供一种操作方便，准确度高的水产品中孔雀石绿的快速检测方法。

一种利用适配子快速检测水产品中孔雀石绿的方法，将待测样品与孔雀石绿适配子和带有检测标记物的报告序列混合，报告序列与待测样品中的孔雀石绿可竞争性地与孔雀石绿适配子结合后，检测(用酶相对的显色底物检测)报告序列上的标记物，计算待测样品中孔雀石绿含量。

所述的检测标记物为辣根过氧化物酶、化学发光基团、化学荧光基团或胶体金等。

所述的报告序列的制备：根据获得的孔雀石绿适配子序列，设计合成与适配子序列部分(5’端回文互补序列)互补的报告序列，将检测标记物标记在报告序列上。

所述的孔雀石绿适配子通过如下步骤制得：

(1)构建一个序列长度约为80个碱基的随机ssDNA文库，ssDNA序列两端带有限制性内切酶位点的固定序列、中间为35个序列随机的碱基，根据ssDNA序列两端的固定序列设计PCR引物；

(2)采用不对称PCR法或生物素-链亲和素磁珠法对步骤(1)得到的ssDNA文库进行扩增；

(3)利用孔雀石绿-OVA偶联物包被微孔板介质法或高效毛细管电泳方法从扩增后的ssDNA文库中进行SELEX筛选，得到与孔雀石绿特异结合的ssDNA即孔雀石绿适配子。