[发明专利]可高产中性蛋白酶的米曲霉菌株及其在固态基质上的发酵方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种米曲霉菌株及其在固态基质上的发酵方法。

背景技术

中性蛋白酶作为一种生物催化剂已广泛应用于食品、酿造、医药等行业。中性蛋白酶的生产也有较为长久的发展历史。然而，目前国内生产的中性蛋白酶大多为工业级，其发酵产物的后处理采用喷雾干燥法，有的甚至还延用硫铵盐析等工艺。少量的食品级中性蛋白酶，由于其制造工艺复杂，价格较为昂贵。目前，无论是应用于畜禽饲料的复合酶或是应用于水产饲料的复合酶中所含的中性蛋白酶基本采用工业级的中性蛋白酶。而针对动物生理和饲料组成而开发的饲料级的高活性中性蛋白酶报导甚少。

胰蛋白酶抑制剂和大豆凝集素是饼粕类饲料原料中的抗营养因子。消除这类物质的方法有物理、化学、生物等多种。胰蛋白酶抑制剂和大豆凝集素本质上也是蛋白质，已有报导多种蛋白酶如中性、碱性蛋白酶能分解植物蛋白中的抗营养因子并使之部分失活，但未见成功利用这些蛋白酶制成水产饲料酶制剂，并能消除水产饲料中植物蛋白抗营养因子如胰蛋白酶抑制剂和大豆凝集素的文献报导。具有高产中性蛋白蛋白酶生产菌的选育及高效能的发酵工艺，提供廉价的以中性蛋白酶为主的水产饲料专用酶，是该产品实行产业化生产的关键前提。

发明内容

本发明解决了现有技术所存在的上述问题，提供了一种高产中性蛋白蛋白酶的米曲霉菌株。

本发明还提供了一种上述米曲霉菌株在固态基质上的发酵方法。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案解决的：

一种可高产中性蛋白酶的米曲霉菌株(Aspergillus oryza)ZW-06，CGMCCNo.1754。

发明人从若干米曲霉菌种、黑曲霉菌种以及从中科院微生物所、中科院土壤所、上海工业微生物所引进的若干米曲霉菌种及从土壤样本中分离获得的不同菌属的菌种，在选择性培养基上经初筛、复筛，获得一株代号为ZW的米曲霉菌株产中性蛋白酶活性最高。选定该菌株作为进一步诱变选育的出发菌株。

出发菌株的选育：初筛：将不同菌属的钭面菌种培养好后，用无菌水制成孢子悬浮液(孢子浓度在10⁴～10⁶个/ml)，分别涂布于初筛平板培养基上，30℃培养2-4天，比较各菌种在初筛平板培养上所产生的透明圈大小，以透明圈大的菌种作为初筛入选菌种。复筛：将初筛入选钭面菌种制成孢子悬浮液(孢子浓度在10⁶～10⁸个/ml)，接入发酵基础培养基(固体)，30℃培养2-4天，培养结束后于35-40℃烘干，按本发明下述的测定方法检测中性蛋白酶活性。以发酵性能优良，产酶活最高的菌株作为出发菌株。

所述的初筛培养基：干酪素0.4％，Na₂PO₄.12H₂O 0.1％，KH₂PO₄0.036％，BaCL₂ 0.4％，琼脂2％。

发酵培养基：麸皮78％，豆粕粉18％，(NH₄)₂SO₄2％，产酶诱导剂2％，加水使培养基含水率达55％-60％。

菌株的复合诱变选育：将在马铃茹葡萄糖琼脂(PDA)斜面上生长成熟的ZW-06#菌株的新鲜孢子，用无菌水洗下，并制成单孢子悬浮液(孢子浓度在107-108个/ml)。分别取2ml单孢子悬浮液于试管，置钴源室进行辐照处理。处理剂量为0(ck)，3万，5万，7万、10万和15万R(伦琴)。经Co60辐照处理后，吸取各处理的悬浮液，逐步稀释101、102、103、104、105、106、107倍，涂布于PDA平板培养基上，每个稀释度3个平板，28-30℃下培养48-72h后，挑取不同形状的单孢菌落于PDA斜面，在28-30℃下培养72-96h后，进行诱变菌种的三角瓶固体发酵的初筛、复筛及菌株间的多重比较，获得目的菌株ZW-06#，所产中性蛋白酶活达15000U/g干基。

本发明所述菌株的具体分离得到为：

菌株初筛：

将斜面上菌株用10ml无菌水冲洗孢子，吸取1ml接入发酵基础培养基，30℃恒温培养48h，进行中性蛋白酶酶活测定。菌株编号7，8，9，23，25，26，27，50，64的菌株酶活提高量都高于对照50％以上，将这些菌株挑出接入斜面，作为复筛的菌株。

菌株复筛