[发明专利]一种制备骨形态发生蛋白BMP－2成熟肽的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及制备骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的方法，特别是获得与天然BMP-2成熟肽氨基酸序列完全一致的BMP-2成熟肽的方法。

(二)背景技术

骨形态发生蛋白-2(Bone Morphogenetic Protein-2，BMP-2)属于转化生长因子超家族成员。BMP具有诱导未分化间充质细胞向软骨、骨分化，并且对胚胎骨骼及多种器官的形成和发育起着重要调节作用。BMP独特的诱导成骨活性使其在骨骼损伤与疾患，如骨折、骨缺损及口腔颇面外科中具有广阔的应用前景。近年来，通过DNA重组技术，十多种重组BMP蛋白在基础及临床应用上均得到了广泛研究，对BMP在生物进化，发育和遗传等方面作用的研究正不断深入。

BMP在细胞内先以前体的方式产生，包括信号肽、前肽和羧基端的成熟肽。成熟肽中含有7个高度保守的半胱氨酸，它们形成三个链内二硫键及一个链间二硫键并将两条多肽链连接为二聚体，BMP前体蛋白经过N位糖基化，蛋白水解酶裂解及二聚体化而形成BMP成熟肽，其活性形成多为其同源二聚体，没有糖基化的同源二聚体仍然具有生物学活性。多种组织细胞在胚胎发育的不同阶段表达BMP，并已从牛、鼠、兔、人等多种动物骨组织中分离出了BMP。另外，牙质、胎盘、骨肉瘤等组织中均含有丰富的BMP。应用放射免疫技术能检测到血清中的BMP，成年人约14-18n/mlg，儿童为20-72ng/ml。

天然BMP-2成熟肽的第一个氨基酸不是甲硫氨酸，常规的制备技术是在成熟肽或截短型的N末端添加甲硫氨酸，利用大肠杆菌直接表达，包含体复性法制备BMP-2，如华东基因技术研究所开发截短型的rhBMP-2，去除N端7个氨基酸后，人为添加一个甲硫氨酸，以其密码子ATG作为起始密码子，在大肠杆菌胞内高效表达，包含体蛋白复性得到有生物活性同二聚体。

在本发明之前，现代医学33卷5期(2005/10)康春雨章庆国发表的《人骨形态发生蛋白-2真核表达质粒的制备、转染及表达》介绍了制备携带有hBMP-2的全长真核表达质粒pcDNA3.1-BMP2的方法，通过脂质体法将所得到的重组真核质粒转染到兔骨髓基质细胞中，用G418进行梯度筛选，从而得到能够稳定表达hBMP-2的细胞克隆。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测骨髓基质细胞(MSCs)hBMP-2mRNA的表达。

中国专利申请CN1484651介绍了将蛋白质在原核生物中表达，该被表达蛋白质氨末端由一种TGF-β超家族的蛋白质的前序列或其部分组成，将蛋白质或另一种TGF-β超家族蛋白质的成熟区域连接到该蛋白质上，所连接上的蛋白质具有和成熟区BMP-2至少35％的同源性。蛋白质的表达在至少有一部分蛋白质以包含体的形式而获得。

众所周知，利用原核体系表达药用蛋白具有成本低廉，易于大规模生产的优点。由于去糖基化的BMP-2仍然有生物学活性，这为原核体系表达BMP-2创造了条件，华东基因技术研究所成功地利用大肠杆菌制备得到具有生物学活性的重组人BMP-2。但是得到的产物与天然的BMP-2氨基酸序列不一致，用于人体可能产生免疫原性。利用包含体制备目标蛋白虽然具有成本低的优点，但是包含体中含有一定的杂蛋白和核酸，目标蛋白占总蛋白的80％左右。

(三)发明内容

本发明提供了一种制备骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的方法，该方法制得的产物可与天然BMP-2成熟肽氨基酸序列完全一致，为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案，本发明制备BMP-2成熟肽的方法包括如下顺序步骤：

(1)删除DsbA基因信号肽第2～18个氨基酸编码基因，保留第一个甲硫氨酸的密码子作为起始密码子，得到编码不含信号肽的DsbA的DNA片段，将该片段重组于表达载体中，获得重组质粒1；所述DsbA基因可以大肠杆菌染色体的DNA作模板扩增出来，也可用pET等含有DsbA基因的质粒作为模板扩增出来，用质粒做模板更容易一些。从理论上讲也可以用化学合成的方法人工获得目的DsbA基因。

(2)将编码骨形态发生蛋白BMP-2完整成熟肽的DNA重组于重组质粒1中DsbA基因的下游，获得重组质粒2；

(3)将重组质粒2转化入宿主菌株的菌体中，得到工程菌，所述宿主菌为无硫氧还蛋白还原酶缺陷的大肠杆菌宿主的DE3溶原菌；

(4)工程菌在含有抗生素的培养基中培养，添加诱导剂使目的基因表达；

(5)工程菌细胞经破菌，分离纯化得到BMP-2融合蛋白；

蛋白酶酶切BMP-2融合蛋白，经分离得到所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽。