[发明专利]一种制备骨形态发生蛋白BMP－2成熟肽的方法

权利要求书

1. 一种骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的制备方法，其特征在于所述方法包括如下顺序步骤：

(1)删除DsbA基因信号肽第2～18个氨基酸编码基因，保留第一个甲硫氨酸的密码子作为起始密码子，得到编码不含信号肽的DsbA的DNA片段，将该片段重组于表达载体中，获得重组质粒1；

(2)将编码骨形态发生蛋白BMP-2完整成熟肽的DNA重组于重组质粒1中DsbA基因的下游，获得重组质粒2；

(3)将重组质粒2转化入宿主菌株的菌体中，得到工程菌，所述宿主菌为无硫氧还蛋白还原酶缺陷的大肠杆菌宿主的DE3溶原菌；

(4)工程菌在含有抗生素的培养基中培养，添加诱导剂使目的基因表达；

(5)工程菌细胞经破菌，分离纯化得到BMP-2融合蛋白；

(6)蛋白酶酶切BMP-2融合蛋白，经分离得到所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽。

2. 如权利要求1所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中所述DsbA基因来自质粒pET39。

3. 如权利要求1所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中宿主菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。

4. 如权利要求1所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的制备方法，其特征在于所述步骤(4)中目的基因的表达在缺乏氧化环境条件下进行。

5. 如权利要求1所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的制备方法，其特征在于所述步骤(6)中蛋白酶为下列之一：肠激酶，重组肠激酶轻链。

6. 如权利要求1～5之一所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中，重组质粒2中骨形态发生蛋白BMP-2完整成熟肽的DNA与DsbA基因的下游之间，还重组有编码“Linker-6His-蛋白酶识别位点”的序列。

7. 如权利要求6所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的制备方法，其特征在于所述蛋白酶识别位点为肠激酶或凝血因子。

8. 如权利要求1所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的制备方法，其特征在于所述方法按如下顺序步骤进行：

(1)以含有DsbA基因的质粒pET39作为PCR模板，利用PCR技术删除pET39中的DsbA信号肽基因第2～18个氨基酸编码基因，保留第一个甲硫氨酸的密码子作为起始密码子，获得的DNA片段重组于表达载体中，获得重组质粒1：pET39(SP-)；

(2)将骨形态发生蛋白BMP-2完整成熟肽的DNA重组于重组质粒1中DsbA基因的下游，获得重组质粒2：pET39(SP-BMP-2)；

(3)将重组质粒2：pET39(SP-BMP-2)转化入宿主菌株大肠杆菌的菌体中，得到工程菌；

(4)工程菌在Luria-Bertani培养基中培养，使目标融合蛋白得到表达；

(5)工程菌细胞经破菌，分离纯化得到BMP-2融合蛋白；

(6)以肠激酶酶切BMP-2融合蛋白，经分离得到所述的骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽。