[发明专利]制备冻干基因工程菌感受态细胞的生产工艺及保护剂配方

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因工程宿主菌活菌冻干粉剂，在生物技术研究、开发、生产及检测中都有着广泛的应用，属于生物技术中最为基础的配套消耗制剂之一。

背景技术

基因工程是在分子生物学和分子遗传学综合发展的基础上于本世纪70年代诞生的一门崭新的生物技术科学。它的一个重要特征就是外源遗传物质——核酸分子在不同的寄主生物中可以进行繁殖，能够跨越天然物种屏障，把来自任何一种生物的基因放置到新的生物中，而这种生物可以与原来生物毫无亲缘关系，这种能力也决定了其必将在广泛的科学领域中都会得到应用。

一般来说，基因工程具体实验过程是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体的条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更容易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源遗传物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。简而言之，所有的操作都要经过最为基础的出发过程：获得目的基因→连入载体→转化进入基因工程宿主菌中扩增放大→其它的具体实验。逐一分析其具体的过程，便可对基因工程所用具体研究方法和其所需的配套试剂有清晰的认知。目的基因因实验的要求和目的而千变万化，获得目的基因的方法也分为直接分离和PCR扩增法，与之相关的核酸分离试剂盒和PCR扩增配套试剂成为一些生物公司的主打产品，其中不乏一些世界知名企业，如以核酸分离试剂盒而扬名世界的德国QIAGEN公司；以PCR系列产品而著称的ABI、TAKARA等公司。说到载体，一些经典的克隆载体和系列表达载体由一些国外大公司研发并得到专利保护，经过数十年来的市场验证，基本已经形成一定意义上的垄断，如Novagen公司的pET系列表达载体，其它也包括某些有特定应用的pUC系列克隆载体，穿梭表达载体，自杀性质粒载体等。至于基因工程宿主菌概括的说，其应该是一种活体细胞，可以使一种确定的DNA小片段(载体和目的基因的连接体)在其中进行繁殖，这样实现少量DNA样品“拷贝”出大量的DNA，而且是大量没有污染任何其它DNA序列的、纯净的DNA分子群，进而实现分子扩增，或直接产生出一定量的目的产品(可以是蛋白也可以是通过生物转化而产生的一些次级代谢产物)。经过遗传驯化的大肠杆菌菌系由于其自身的特点而成为基因工程宿主菌的首选。

作为宿主菌，大肠杆菌有以下优势：1.遗传背景和生理特性研究相当彻底，已经有很多不同抗药性、不同营养依赖型和不同校正突变型的菌种供选择应用，可以根据不同的载体而选择不同的菌种。2.尽管大肠杆菌细胞的空间小，但繁殖能力强，在营养条件充足、培养条件适合时，20分钟即可完成一个世代，生长非常迅速。经过一定的培养条件优化，可以实现高密度发酵，而且大规模发酵成本低，具有巨大的生产潜力。3.基因表达水平一般较真核系统高，某些外源基因在大肠杆菌中的表达量可达总蛋白的5％～70％，且下游纯化工艺简单、方便自动化控制，易于产业化。作为表达系统大肠杆菌由于一些限制因素还有一些不尽人意之处，因此近年来一些其它的生物体，如：芽孢杆菌、酵母菌、丝状真菌或者是动物细胞等作为表达的宿主菌越来越受到重视，应用也越来越广泛。但是，不论使用哪种表达受体体系都要以大肠杆菌作为最初基因扩增的宿主菌，与这些表达系统相对应的载体也要求购建成为穿梭载体，以便于先在大肠杆菌中扩增后再通过转化或转染进入其它的受体体系中。综上所述，鉴于其自身的遗传优势和传统的应用经验，大肠杆菌已经成为基因工程实验操作过程中最基础的工具菌株。

感受态是大肠杆菌处于能够高效率的获得外源基因的一种状态，它的获得是通过控制大肠杆菌基因工程菌的培养条件，使其群体生长至某一状态，一般选择在对数生长早期，利用含有某些二价金属离子的试剂低温条件下处理，造成大肠杆菌的细胞壁合成缺陷，使得外源目的基因便于进入大肠杆菌，同时还可以维持细胞高生长及代谢活性的一种细胞状态。由于感受态细胞的细胞壁缺陷而且还要维持在一种高转化效率的状态，因此非常脆弱，常规的制作方法必需使用-80℃冰箱保存，以干冰进行运输，而且保存2个月后其生物活性衰退明显。目前，国内大部分的代理商和分销商并不提供-80℃冷藏设施，而且干冰的定点制备和运送也给销售人员带来极大的不便。另外，一些科研单位由于条件限制也会在保存过程中造成产品的不稳定甚至生物活性完全丧失，这些都严重影响了该产品的质量稳定性和市场推广应用。