[发明专利]与肿瘤转移相关蛋白PRL－3特异性结合的12肽及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及利用噬菌体展示文库技术筛选能与肿瘤转移相关蛋白PRL-3特异性结合的多肽的方法，具体地说，是应用随机12肽噬菌体展示文库筛选与PRL-3特异性结合的噬菌体，得到能够影响PRL-3磷酸酶活性的12肽序列。

背景技术

从原位生长的肿瘤到转移的肿瘤这个转变，即肿瘤转移，是肿瘤发生过程中最危险的变化。它包含许多为完成肿瘤转移而进行的一系列复杂事件[Ridley A.转移的分子开关.Nature，406：466-467，2000]。

近来，Zeng和他的同事发现中国仓鼠卵巢细胞稳定地表达PRL-3，显示出增强的活动性，入侵活性和诱导裸鼠转移肿瘤形成。这些发现为将PRL-3作为肿瘤转移的早期诊断和药物开发的新靶点提供了依据，因为现在几乎没有肿瘤转移的治疗靶点。

现有噬菌体展示技术是对纯化了的蛋白进行筛选，得到与该蛋白特异结合的寡肽或抗体。在此基础上我们运用噬菌体展示技术对细胞表面抗原进行筛选，通过这种方法可以得到对细胞表面特异结合的寡肽分子。我们的方案克服了以往细胞筛选中的一些问题，主要是细胞表面成分复杂而且未知，细胞筛选的非特异性较大，背景值高，而且转移与非转移肿瘤细胞间细胞表面差异小。

发明内容

本发明的目的是应用噬菌体展示文库技术对PRL-3进行筛选，以获得能与肿瘤转移相关蛋白PRL-3特异性结合的12肽。因为有许多证据表明PRL-3与肿瘤转移相关，所以它是潜在的肿瘤转移早期诊断和药物开发的新靶点。

本发明应用12肽噬菌体展示文库对PRL-3进行了4轮筛选，获得了能与肿瘤转移相关蛋白PRL-3特异性结合的12肽，其氨基酸序列如下：

Gln-Tyr-Thr-Trp-Ile-Phe-Pro-Pro-Met-Gly-Tyr-Gln。

本发明获得的12肽能够与肿瘤转移相关蛋白PRL-3特异性结合，并且能够影响PRL-3的磷酸酶活性。

与肿瘤转移相关蛋白PRL-3特异结合的12肽的筛选和鉴定包括如下步骤：

第一、经过对人再生肝脏磷酸酶-3(PRL-3)进行四轮筛选，获得能与PRL-3选择性结合的重组噬菌体；

第二、上步得到的重组噬菌体对PRL-3结合能力的测定；

第三、从上步得到的噬菌体库中分离制备单克隆噬菌体；

第四、上步得到的单克隆噬菌体基因组单链DNA的提取和获得寡肽序列；

第五、上步得到的单克隆噬菌体对PRL-3进行ELISA测定；

第六、磷酸酶活性实验证明第四步得到的12肽对PRL-3磷酸酶活性的影响。

本发明所述的与肿瘤转移相关蛋白PRL-3特异性结合的12肽，可应用于制备检测肿瘤转移的药物。

以及作为药物开发的新靶点，应用于制备抑制肿瘤转移的药物中。

本发明的有益效果是：

本发明提供的12肽能够特异性的与PRL-3结合，并能够影响PRL-3磷酸酶的活性，对PRL-3在肿瘤转移中的作用的研究以及靶向药物的设计与研发具有很高的应用价值。

附图说明

图1是噬菌体展示各轮PRL-3特异性结合的噬菌体数，以空孔作为对照；

图2是经过四轮筛选得到的噬菌体以及原噬菌体库与PRL-3及对照结合能力的比较；

图3是15个噬菌体单克隆分别与PRL-3以及固定了his标签的GFP作ELISA检测；

图4是证明筛选所得12肽对肿瘤转移相关蛋白PRL-3磷酸酶活性的影响，图A是加入不同量12肽-GST后PRL-3磷酸酶活性的变化；图B是加入不同量GST后PRL-3活性的变化。

具体实施方式

实施例1：经过四轮筛选获得能与PRL-3特异性结合的重组噬菌体

1.第一轮筛选与洗脱：

①.用NaHCO₃溶液稀释蛋白为100μg/mL的溶液，要求NaHCO₃的终浓度为0.1M。加100μL该溶液到96孔板的一个空中，4℃过夜固定。

②.加150μL新鲜配制的含2％奶的PBS(MPBS)溶液到固定了蛋白的孔中，封闭未结合蛋白的部分。室温摇摆平台放置1小时。

③.与此同时，将噬菌体(10¹¹pfu)加到100μL MPBS中，加到一个空孔中，室温摇摆平台放置1小时，目的是将可以与ELISA板结合的噬菌体吸收掉。