[发明专利]布鲁氏菌分子标记和毒力缺失弱毒疫苗及制备方法

权利要求书

1.一种可区分自然感染或野毒感染的布鲁氏菌弱毒疫苗ΔS19-1，特征在于：布鲁氏菌需弱毒疫苗株S19的Bp26基因缺失而成ΔS19-1。

2.根据权利要求1所述的布鲁氏菌弱毒疫苗ΔS19-2，特征在于：ΔS19-1毒力基因Bmp18缺失而成弱毒疫苗株ΔS19-2。

3.根据权利要求1或2限定的疫苗制备方法，其特征在于：根据布鲁氏菌基因组序列，设计PCR引物，扩增出分子目标基因Bp26同源重组的引导序列，在T载体上对其进行改造，在它的中间用限制性内切酶去除其中的500bp，在这个位置上连接上Luc NF+基因，破坏了Bp26的原有序列，然后把改造好的基因片段连入自杀性的质粒上pBLs。

4.根据权利要求3限定的疫苗制备方法，其特征在于：主要包括以下步骤：

(1)以布鲁氏菌弱毒疫苗基因组为模板，设计引物，用PCR的方法，扩增出分子标记目标基因的同源重组引导序列，而后克隆到T载体上对目标基因改造；

(2)用(1)得到的基因片段与复制启动子为pUC oir的载体相连，而后将sacB基因连接到这个载体的适当位置，构建成同源重组载体(自杀性质粒)；

(3)使步骤(2)得到的重组载体转化到布鲁氏菌中去；利用同源重组载体自带的筛选标记筛出同源重组单交换子，利用sacB基因筛选出同源重组的双交换子，得到本发明的分子标记疫苗株ΔS19-1；

(4)重新设计引物，从布鲁氏菌基因组中，扩增出目标毒力基因的同源重组引导序列，使用(1)～(3)的方法使ΔS19-1的毒力缺失，得到本发明的分子标记、毒力缺失弱毒疫苗株ΔS19-2。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所说的弱毒疫苗株为S19。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所说的分子标记目标基因为Bp26。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所说的分子标记目标基因是指用限制性内切酶切除其中500bp，而后在这个位置上连接上Luc NF+报告基因。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所说目标蛋白是BP26蛋白。

9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所说的目标毒力基因是Bmp18基因。

10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所说目标毒力基因改造是指用限制性内切酶切除其中的200bp，而后使之相联。