[发明专利]血型A抗原表位模拟多肽及其筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及多肽生物技术领域，具体地说是血型A抗原表位模拟多肽及其筛选方法。

背景技术

A血型抗原的化学结构属于糖蛋白，它们的结构主要涉及到两个分离座位的基因；H座位基因和A座位的基因，这些基因不直接产生抗原，而是产生糖基转移酶，糖基转移酶决定了A血型抗原的特异性。因此糖基转移酶是基因的直接产物，而血型抗原决定簇的单糖或寡糖是基因的间接产物。A血型的抗原决定簇是连接在血型物质的多聚糖前体或称为载体链上。血型物质的前体是多糖结构。目前认为A血型的抗原决定簇是低聚糖链结构，但其确切结构还不是很清楚。人体中ABO抗原广泛存在于多种细胞的细胞膜上以及体液和分泌液中。正常情况下，每个个体可针对自己缺乏的A、B和H抗原，自然产生相对的特异性抗体。A型的抗-B和B型的抗-A主要是IgM类抗体，O型的抗-A、抗-B和抗-A、B通常是IgG类抗体。ABO抗体是移植排斥反应的重要参与者。

噬菌体展示技术是后基因组时代蛋白质研究的重要工具。噬菌体展示技术的优越性在于：外源多肽被展示于噬菌体表面的衣壳蛋白上；所展示外源蛋白或多肽的基因型和表型在单个噬菌体中得到统一；筛选的高效性；操作过程简单；耗费低廉。这项技术自确立以来已广泛用于对蛋白质和(或)非蛋白质之间配体-受体相互作用位点的研究。在抗原表位、细胞内信号分子相互作用残基的发现以及药物筛选等方面应用十分广泛。有学者甚至认为噬菌体展示文库中的随机多肽库的应用范围仅仅受到人的想象力的限制。本技术利用噬菌体展示的多肽模拟天然存在的抗原表位，其中具有相同抗原表位特性而又与天然抗原表位在成分或结构序列上不同的多肽被成为模拟表位(mimotope)。具有模拟抗原表位特性的噬菌体展示技术被广泛用于模拟存在于糖蛋白、多糖等成分中抗原表位。

目前在临床移植治疗中由于缺乏合适的供体，因此发展组织ABO不相容器官移植成为必要。为了降低抗体介导的超急性、急性排斥反应，就需要首先用血浆置换的方法去除ABO抗体。同时对受着血浆抗-A/B抗体水平的检测也显得尤为重要。基于血型抗原的抗体特异性亲和滤除是减少血浆中抗体的最有效办法。另外，目前所采用的血型抗体鉴定方法多是试管法，用目测来判断结果，主观因素影响程度高，检测结果难以统一标准化。另外凝集反应主要是检测IgM，而IgG的检测仍是一个挑战。采用包被血型抗原检测抗体的ELISA方法则可以解决这些问题(Rieben，1997；Galili，2002)，并且ELISA方法敏感度高，可以充分利用ELISA自动检测系统从而节省资源。由于目前在亲和滤除血型抗体和抗体检测试验中所用的ABO抗原都是天然来源，或人工合成的寡糖成分，这些抗原存在来源不足，纯度不高，不易于保存等缺点。

发明内容

本发明目的就是利用血型A单克隆抗体筛选噬菌体随机十二肽库以获得血型A抗原表位的模拟多肽，从而提供血型A抗原的表位模拟多肽以及提供一种血型抗原表位模拟多肽的筛选方法。

本发明所述的两种血型A抗原表位模拟多肽分别有如下氨基酸序列

Glu-Tyr-Trp-Tyr-Cys-Gly-Met-Asn-Arg-Thr-Gly-Cys

或Gln-Ile-Trp-Tyr-Glu-Arg-Thr-Leu-Pro-Phe-Thr-Phe

本发明的筛选方法为：

(1)、用NaHCO₃缓冲液稀释血型A抗原特异性的单克隆抗体NAM87-1F6并包被ELISA板，置于湿盒中4℃孵育16小时；

(2)、用封闭缓冲液室温封闭，用含吐温20的TBS洗涤缓冲液进行洗涤；

(3)、向包被有单克隆抗体的微孔中加入筛选用噬菌体，缓慢震摇使噬菌体与包被抗体充分接触，用含吐温20的TBS洗涤去除未结合的噬菌体；

(4)、用甘氨酸-盐酸缓冲液室温洗脱结合的噬菌体，中和后在宿主菌ER2738中扩增噬菌体，作为下一轮筛选的投入物，同时测定洗脱物和投入物的滴度；

(5)、重复上述步骤共进行三轮筛选，从第三轮筛选后的洗脱物滴定平板中随机挑选32个噬菌体克隆，进行噬菌体ELISA、噬菌体微筛选，得到本发明物，并采用DNA测序和噬菌体凝集抑制实验等方法分析。