[发明专利]检测羟基自由基的纳米银分光光度法

说明书

技术领域：

本发明涉及羟基自由基的检测方法，具体是用纳米银作为羟基自由基的捕获剂，以分光光度计测定被测体系的吸光度的方法——纳米银分光光度法。

背景技术：

羟基自由基(·OH)是目前已知化学性质最活泼的一种活性氧分子，可以发生电子转移，夺取氢原子和羟基化等反应，使糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类发生氧化。由于·OH的氧化能力强、寿命短、对机体危害大，它与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬有关；此外，羟自由基清除率是反映药物抗氧作用的重要指标，因此，在基础医学、临床医学、预防医学、药学等领域，已对自由基开展了大量的研究。

此外，在已知的氧化剂中，·OH的氧化能力仅次于F₂，是一种非选择性的氧化剂，能很容易的氧化各种有机物和无机物，氧化效率高，反应速度快。因而在大气化学、天然水体化学和废水深度氧化等的研究中，涉及许多自由基参与的化学反应，自由基与污染物的转化和清除密切相关。但是，由于自由基非常活泼，浓度低、存在的寿命短，因此建立一种灵敏快速测定·OH的方法尤为重要。。

目前国内外测定羟基自由基的方法主要有：电子自旋共振法(ESR)，高效液相色谱法(HPLC)，化学发光法(CL)，光度法，电化学法、荧光法等。其中，ESR法可直接用于检测和研究具有未成对电子的自由基与过渡金属离子及其化合物，但由于此方法是利用自旋捕捉剂与短寿命自由基结合生成相对稳定的自由基，即自旋加合物，然后进行ESR测定。由于自旋加合物的寿命仍然很短，只有几分钟或几十分钟，因此，必须捕捉自由基后立即进行EPR测定，故对样品的制备及检测有很大的限制。HPLC法也是一种常用的间接检测·OH的方法，该方法是必须先选择合适的化合物捕获体系中的自由基，使之生成具有一定稳定性，且能被液相色谱检测的产物，然后用HPLC液相色谱测定，其中，二甲基亚砜(DMSO)捕集自由基测定法所用的DMSO有毒性，能迅速透过皮肤进入体内；而水杨酸捕集自由基HPLC测定法是用电化学检测器测定·OH与水杨酸的生成物2，3-二羟基苯甲酸和2，5-二羟基苯甲酸，其检测限分别为10和5fmol。HPLC法选择性较好，能同时检测几种自由基，但所用仪器价格昂贵，不易普及推广。徐向荣等用酵母作发光底物，用化学发光法测定了Fenton反应产生的·OH，用于模拟染料废水处理中·OH的测定，重现性好，但所用试剂不易获得，且方法精密度较差。电化学分析法即利用脱氧核糖与Fenton体系产生·OH作用，在酸性条件下经过讲解生成丙二醛、丙二醛在于甲醛、氨反应生成电活性产物3，5-二乙酰-1，4-二氢吡啶，通过电化学分析法间接定量羟基自由基的产生量，但此法反应步骤较多且所用醛类试剂危害人体健康。荧光法是利用Fenton反应产生的·OH能将Ce³⁺氧化成Ce⁴⁺，测定Ce³⁺的荧光强度变化即可间接测定羟自由基的产生量，该方法重现性好、操作简便快速。此外，还有激光诱导荧光法、化学离子化质谱法、化学扩大法也可用来测定羟基自由基，但不易普及推广或仪器价格昂贵等。

已有的分光光度法如徐向荣等在《化学发光法测定Fenton反应中的羟基自由基及其应用》(环境科学，1998年19卷第2期)用DMSO捕集Fenton反应体系中的·OH，产生的甲基亚磺酸与坚牢蓝BB盐反应，生成的重氮化合物经甲苯∶正丁醇(3∶1)混合物萃取后，用分光光度法在420nm处进行比色测定，这种方法用来研究羟基自由基的产生与清除准确可靠，有较好的重现性。贾之慎等用水杨酸捕集Fenton反应体系中的·OH，生成的2，3-二羟基苯甲酸用乙醚萃取，用钨酸钠和亚硝酸钠显色，然后用分光光度计测定其510nm处的吸光度，结果显示吸光度随水杨酸浓度、Fe²⁺浓度及H₂O₂的浓度增加而上升，认为这体现了·OH生成的变化规律，这种方法是一般实验室可采用的简便实用的方法。此外还有细胞色素C光度法，金鸣等在《邻二氮菲-Fe²⁺氧化法检测H₂O₂/Fe²⁺产生的羟自由基》(生物化学与生物物理进展，1996年第23卷第6期)中的邻二氮菲-Fe²⁺-H₂O₂体系分光光度法，分光光度法测定·OH不需要昂贵的仪器，简便、快速，易推广普及，但测定过程中的干扰因素较多，准确性、灵敏度和选择性有待提高。

发明内容：